日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇技術(shù)操作步驟：

一,、原理
在不加條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶,，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、PH改變、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡,。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點降低,。在緩慢的凍結(jié)條件下,，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成,。

細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快,，使之迅速通過細(xì)胞易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長,，活力受損不大,。
目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性,，分子量小,，溶解度大，易穿透細(xì)胞,。

二,、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）,、離心管,、吸管、離心機(jī)等,。
試劑：0.25％胰酶,、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）,。
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,，使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同,。配好后4℃下保存,。

三、操作步驟
一、凍存
1,、消化細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
2,、1000rpm離心10分鐘,，棄上清液。
3,、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右,。
4,、將懸液分至凍存管中，每管1 ml,。
5,、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,，封口要嚴(yán),，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。
6,、貼上標(biāo)簽,，寫明細(xì)胞種類，凍存日期,。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩,。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮,。
注意：操作時應(yīng)小心,，以免液氮**。液氮定期檢查,，隨時補(bǔ)充,，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月,。

二、復(fù)蘇

1,、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞,，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2,、從液氮中取出凍存管,、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3,、打開凍存管,，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。
4,、1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液。
5,、沉淀加10ml培養(yǎng)液,，吹打均勻，再離心10分鐘,，棄上清液,。
6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,，37℃培養(yǎng),，**天觀察生長情況。