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細胞的凍存與復蘇技術操作步驟：

一,、原理
在不加條件下直接凍存細胞時,，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷,、電解質升高,、滲透壓改變、脫水,、PH改變,、蛋白變性等，能引起細胞死亡,。如向培養(yǎng)液加入保護劑,，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,，能使細胞內(nèi)水份在凍結前透出細胞,。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞易受損的－5～0℃,，細胞仍能生長,，活力受損不大,。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油,，它們對細胞無毒性，分子量小,，溶解度大,，易穿透細胞。

二,、試劑和器材
器材：液氮罐,、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管,、吸管,、離心機等。
試劑：0.25％胰酶,、培養(yǎng)基,、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）。
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,，使其終濃度達5—20%,。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存,。

三,、操作步驟
一、凍存
1,、消化細胞,，將細胞懸液收集至離心管中。
2,、1000rpm離心10分鐘,，棄上清液。
3,、沉淀加含保護液的培養(yǎng),，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右,。
4,、將懸液分至凍存管中，每管1 ml,。
5,、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口要嚴,，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂,。
6、貼上標簽,，寫明細胞種類,，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩,。
7,、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心,，以免液氮**,。液氮定期檢查，隨時補充,，不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

二,、復蘇

1,、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水,。
2,、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動,。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化,。
3、打開凍存管,，將細胞懸液吸到離心管中,。
4、1000rpm離心10分鐘,，棄去上清液,。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液,，吹打均勻,，再離心10分鐘，棄上清液,。
6,、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng),，**天觀察生長情況,。