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       PCR反應(yīng)條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度,、時間和循環(huán)次數(shù)上，溫度過高,，延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果有很大的影響,，以下總結(jié)方法技巧。
 

　　溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點,。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。
 

　　1,、變性溫度與時間

　　變性溫度低，解鏈不是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下,，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間,，但溫度不能過高,，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性,，就會導(dǎo)致PCR失敗。
 

　　2,、延伸溫度與時間

　　Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
 

　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
 

　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
 

　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
 

　　高于90℃時,， DNA合成幾乎不能進行。
 

　　PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,，常用溫度為72℃,，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴增10Kb需延伸至15min,。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增,，延伸時間要稍長些,。
 

　　3、退火(復(fù)性)溫度與時間

　　退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞,。退火溫度與時間，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
 

　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
 

　　復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)
 

　　在Tm值允許范圍內(nèi),， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec,，足以使引物與模板之間*結(jié)合,。