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ELISA試驗重點操作步驟闡述
閱讀：204 發(fā)布時間：2024-6-24酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,，ELISA)是一種特殊的試劑分析方法,，在免疫酶技術的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術，其試劑易于保存,、結(jié)果判斷較為客觀,，是目前實驗室檢測抗原抗體經(jīng)濟、普遍的試驗診斷方法,。ELISA試驗重點操作步驟闡述如下：
1 ,、試劑的準備
試劑的質(zhì)量如抗原抗體的純度及親和力、標記物的比活性,、滴度及特異性等直接影響檢測結(jié)果,，為保證檢測質(zhì)量,，所有試劑必需經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準、批檢測合格,，臨床評估特異性,、敏感性、穩(wěn)定性較高且在有效期內(nèi)才有使用價值,。不同試劑敏感性,、特異性不盡相同，有報道不同酶標板孔間 A 值差大小可達 15%,，標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定性也相差較大,，所以合理有效的試劑選擇尤為重要，對 ELISA 試劑盒應正確選擇,，定期評價并建立科學的接收標準,，結(jié)合常規(guī)血液篩查情況，對實際的均一性,、適用性,、穩(wěn)定性，選出靈敏度,、特異度及精密性合適的試劑保證檢測結(jié)果的準確,。有報道不同-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液對檢測結(jié)果有區(qū)別，配制抗 HCV-cAg 酶結(jié)合物溶液前應檢測小鼠-IgG 與產(chǎn)品的適配性,。其次試劑盒的儲存方式,、運輸條件及有效期均為影響檢測結(jié)果的重要因素，試劑盒一般 2~8℃冰箱保存,，注意不要緊貼冰箱儲存室后壁以防止試劑凍結(jié)失效,，可避免使用時試劑受溫差影響導致酶標板上凝集小水珠及反應出現(xiàn)溫差而影響抗原抗體的反應。使用前需將試劑盒放置 37℃恒溫箱溫育30min,，且不同,、不同批號的試劑不能混合使用。剩余試劑應及時放入干燥劑密封保存在 2~8℃冰箱,，試劑打開后一周內(nèi)有效,，同時注意做好室內(nèi)質(zhì)檢，確保實驗結(jié)果的可靠性,。
不同方法學的檢驗試劑會使乙肝兩對半結(jié)果出現(xiàn)不同,，如臨床操作中電化學檢測 HBsAg 呈陽性，而采用 ELISA 檢測則呈陰性,，此外,，使用單抗或多抗試劑對檢測結(jié)果同樣造成一定的影響。研究表明 ELISA 檢測細胞因子時需要根據(jù)檢測的細胞因子選擇不同的裂解液進行處理,，避免裂解液對細胞因子產(chǎn)生影響導致假陰性結(jié)果,。
2,、 樣本的采集、保存及預處理
標本的運輸及保存,、檢測人員的自身素質(zhì)均可能對檢測結(jié)果造成不良影響,，為避免出現(xiàn)錯誤樣品應準確標明編號、種類,、受檢者姓名及采集時間,，收集后認真核對，拒收不符合要求的標本及申請單,，嚴格按照拒收制度處理,，同時處理合格標本，做好后續(xù)工作,，避免延誤導致標本出現(xiàn)溶血等其它不良情況,。標本的預處理對檢測結(jié)果有非常明顯的影響，臨床工作中有時為了快速得出檢測結(jié)果在血液開始凝固前強行離心分離血清,，血清中殘留的纖維蛋白絲對實驗結(jié)果造成影響,，標本離心需*且必須待血液凝固后方能分離血清，也可在標本采集時使用帶分離膠的采血管提取,，使用未混入保存液的血液做檢測標本,。在此過程中保證待檢標本新鮮、避免細菌污染,，否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，若不能及時檢測可將分離的血清于 4℃保存,，超過一周于-20℃保存,，避免反復凍融，防止出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。若血清中含有類風濕因子或免疫復合物也將造成假陽性結(jié)果,。
3、加樣 ELISA 檢測
加樣時應垂直將樣本準確加入微孔底部,，注意避免吸頭碰到酶標板上的包被物,，盡量慢吸快放，防止濺出或產(chǎn)生氣泡,，避免液體外濺使血清殘留在反應壁上,。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭,，避免交叉污染,，干吸頭每次加樣前在血清中抽吸三次保證吸樣準確，滴加試劑時建議先將滴瓶搖勻擠去第一滴再加樣,。加樣前先將微孔板平放在板架臺上,，以免對洗板機的自動操作帶來影響,，為了保證加樣的準確性，建議使用準確性高的微量移液器且定期進行校正,。加樣品稀釋液,、酶結(jié)合物應用液、底物應用液及終止液時可采用定量多道加液器,，迅速完成加液過程,，加樣后用不干膠或膠帶紙封好酶標板防止水分蒸發(fā)或雜物進入孔內(nèi)，注意封板膜不可二次利用,，避免交叉污染,，剩余的微孔板、不干膠或膠帶紙與干燥劑一同保存在備用自封塑料袋中,。大批量檢測大型機構(gòu)體檢標本時可采用直接加入適量血清的加樣模式,，經(jīng)濟環(huán)保提高工作效率。
在實際操作過程中,，待檢標本和酶標志物先后順序加入,，于是在競爭法中因為兩者的不同時加入而存在一個“bu公平"競爭現(xiàn)象，研究表明,，競爭法 ELISA 檢測受加樣方法的影響存在統(tǒng)計學意義,，將標本和酶標志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標板小孔杯中可降低抗-HBc 檢測的假陽性率。
4,、 溫育
溫育是 ELISA 至關重要的一步,，不同的溫育環(huán)境對檢測結(jié)果有影響，操作中應嚴格按照說明書控制溫育時間及溫度,，并注意封閉避免邊緣效應,。為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置,，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行,，一般加入待測標本后使其與固相抗原(抗體)置于 37℃環(huán)境下溫育。因為很多恒溫箱的構(gòu)造,，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度,，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為 37℃,。干育和水溫的影響差異較為明顯,，建議使用水溫，注意將固相板放入水中,，防止受熱不均勻,。
溫育時間是影響檢測結(jié)果的一大因素，實際操作過程中工作人員常常試圖縮短溫育時間提高工作效率,，曹青梅等通過實驗證明,，對于低濃度的標本,，待測標本與固相抗體反應時間過短，極易引起漏檢,，反應時間最少 30min 以上,。羅保紅等報道，酶標反應預孵時間在溫室中不超過 15min,，不但能保障 ELISA 檢測抗-HIV,、抗-HCV 的實驗結(jié)果，還能提高試劑檢測的靈敏度,。其傳統(tǒng)溫育采用水溫箱易受污染,，現(xiàn)多采用電熱、電子恒溫培養(yǎng)箱溫育,，研究表明溫育方式對 ELISA 檢測物影響,。陳懷霞報道，ELISA 檢測中,，溫度對抗原,、抗體及酶反應的影響很大，溫度增高,，分子運動加速,，并可能出現(xiàn)非特異性反應，出現(xiàn)假陰性或者假陽性結(jié)果,，檢測控制恒溫 37℃可保證檢測的準確性,。
5、 洗板
洗板目的在于將特異性結(jié)合于固相上的抗原(抗體)與溫育過程中吸附的非特異性成份分離,，使免疫復合物與待測抗體(抗原)呈一定比例,，洗板是否合格直接影響檢測結(jié)果的準確性。洗板應嚴格按照說明控制洗板時間及洗板次數(shù),， ELISA 檢測一般用洗滌液洗板 3 次，洗滌液應嚴格按照操作說明進行稀釋,，洗液應注滿每個微孔并注意洗液不外溢,，垂直甩板避免交叉污染，防止出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果,。使用洗板機洗板可一定程度上避免環(huán)境污染,、提高工作效率，洗滌開始時注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內(nèi)全部液體,，嚴格按照要求設置一定的洗板時間及洗板次數(shù),。洗板過程中注意沖力大小，避免沖力過大導致酶結(jié)合物丟失,，吸光度值偏低,。洗液應根據(jù)不同的酶標板調(diào)整注水量,，注意不要溢出孔外；稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中,，使配出的洗液 pH 在 7.2~7.6 范圍內(nèi),，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無污染,、沉淀,。洗板結(jié)束后將板拍干，應垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上,，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾,。
洗板時還應注意以下問題：(1) 需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于 2μl,；(2)及時更換破損吸液針,，避免破壞底板包被；(3)針對不同酶標板注意調(diào)整吸液頭下降高度,，避免沖洗針頭卡住酶標板,；(4)注意調(diào)整洗液量，洗液量過多將溢出,，過少將達不到洗滌效果,；(5)關機前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道,；(6) 不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用,。臨床操作中，工作人員由于擔心洗板次數(shù)過少達不到去除非特異性物質(zhì)的理想效果而增加洗板次數(shù),，最近研究發(fā)現(xiàn),，隨著洗板次數(shù)的增加樣本檢測的 OD 值降低，造成假陰性結(jié)果及灰區(qū)標本的漏檢,。
6,、 顯色及結(jié)果判斷
試劑顯色時 A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min,，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合,。顯色劑不宜過多，注意避光反應,。顯色是最后一步溫育反應,，酶將無色底物催化反應呈有色，反應的溫度和時間均為影響結(jié)果的重要因素,，目前市場上大多數(shù)進口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃,。一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強,。研究表明,，顯色溫度對實驗結(jié)果有明顯影響，顯色溫度不同,，試劑*低檢測能力差距非常大,，溫度低于 21℃時試劑盒對于質(zhì)控物的檢出能力下降，溫度過低導致結(jié)合反應速率變慢,，顯色不充分,，造成低值陽性結(jié)果的漏檢，所以操作中應嚴格控制溫度,。顯色時間不宜過短,，因為一些低滴度可能不能及時出現(xiàn)反應，造成假陰性結(jié)果,。結(jié)果判斷應按照說明書在規(guī)定時間內(nèi)完成,，研究報道終止反應后的時間對 OD 值結(jié)果有明顯影響，10~15min陽性結(jié)果 OD 值逐漸下降,，陰性結(jié)果的 OD 值有所上升,，所以必須嚴格按照操作說明進行，薛春楊等認為結(jié)果判斷需在加入終止液后 10min 內(nèi)完成,，避免出現(xiàn)孔內(nèi)結(jié)晶影響酶標儀的測試,，避免強光下進行。
在加液和混合過程中產(chǎn)生氣泡,、微孔條底部不透明,、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起吸光值的升高,，易造成假陽性結(jié)果,，若顯色但酶標儀讀值為陰性的灰色值樣區(qū)的樣本不管其是否來源于高危人群均需復檢并參考參比試劑。
7,、 其它因素
實驗室的環(huán)境亦是影響試驗結(jié)果的一大因素,，合理控制實驗室的通風、采光及防塵,，實驗室的溫度及濕度可使用空調(diào)加以控制,，濕度控制在 35%~65%間，并避免噪音及電磁波干擾,。
檢測結(jié)果對受檢者的家庭、生活及工作非常重要,，可能帶來嚴重的精神痛苦及巨大的心理壓力,，因此檢驗工作者應不斷提高自身素質(zhì)，加強使命感與責任心，盡職盡責認真對待每一份待檢標本,，嚴格按照實驗室的標準化操作,，試劑的選擇和準備、樣品的采集和儲存,、操作等方面,，嚴格按照說明書要求，規(guī)范化操作,，同時做好實驗室內(nèi)質(zhì)控,、室間質(zhì)評，排除影響因素,，嚴格控制試驗環(huán)境,，牢牢把關試劑選擇、試驗溫度,、儀器設備等每一環(huán)節(jié),，最大限度地降低檢測的系統(tǒng)誤差，加強自身理論知識的學習,，在工作中總結(jié)經(jīng)驗,、揚長避短，減少人為因素對試驗結(jié)果造成影響,，提高檢測的準確性,，減少假陰性、假陽性結(jié)果的出現(xiàn),。
ELISA 檢測廣泛應用于乙肝,、丙肝、梅毒,、艾滋以及結(jié)核等傳染類疾病的診斷,，對于含有疑似干擾物的待檢樣本做相應分析，在保證結(jié)果可靠的前提下盡量避免二次抽血,。為保證檢驗工作者的自身安全,，操作時必須帶好口罩、手套,，穿好工作衣,，嚴格進行規(guī)范操作，防止交叉感染,。有條件的情況下可使用酶聯(lián)免疫反應加速儀縮短反應時間,，提高工作效率。