化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
常見污染培養(yǎng)細(xì)胞的類型探究
閱讀：144 發(fā)布時(shí)間：2024-6-12 由于缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)等的保護(hù),，體外培養(yǎng)的細(xì)胞沒有對(duì)微生物的防御能力。在體外培養(yǎng)環(huán)境中,，有些微生物在攝取營養(yǎng)物質(zhì)方面有競爭優(yōu)勢,，并在短時(shí)間內(nèi)排出大量代謝產(chǎn)物；有些微生物則附著在細(xì)胞表面或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,。因此,，微生物污染會(huì)對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的正常生存、生長及功能活動(dòng)造成極大干擾,，嚴(yán)重的可致細(xì)胞死亡,。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性也大打折扣,。所以,，保持細(xì)胞生存環(huán)境無微生物污染是體外實(shí)驗(yàn)的前提條件。良好的無菌操作可大大降低細(xì)胞培養(yǎng)中的微生物污染風(fēng)險(xiǎn),。
微生物對(duì)細(xì)胞的影響因污染物和細(xì)胞種類的不同而表現(xiàn)各異,，一般當(dāng)污染物持續(xù)存在時(shí)，輕者細(xì)胞增殖生長緩慢,，分裂相減少,，細(xì)胞變粗糙，輪廓折光增強(qiáng),；重者細(xì)胞停止增殖,，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或從瓶壁脫落,。
若發(fā)生微生物污染,，一般應(yīng)及時(shí)將被污染的培養(yǎng)物及相關(guān)試劑在滅菌后按正規(guī)程序丟棄，與被污染培養(yǎng)物接觸過的器材也應(yīng)及時(shí)消毒滅菌,，防止污染的再次發(fā)生,。微生物污染的消除非常困難,，且應(yīng)保持隔離并嚴(yán)密監(jiān)控，因此不要輕易嘗試消除污染,，除非細(xì)胞至關(guān)重要且不可替代,。由此可見微生物污染的預(yù)防十分重要。為此,，首先介紹如何判斷常見的污染,。
常見污染細(xì)胞的微生物有細(xì)菌、真菌,、支原體,、病毒等，不同污染物對(duì)細(xì)胞的影響有區(qū)別,，真菌和細(xì)菌繁殖迅速,，能在很短時(shí)間內(nèi)（如48 h）壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)，而支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和機(jī)能的影響是長期的,、緩慢的和潛在的,。細(xì)菌、真菌的污染可通過肉眼和常規(guī)顯微鏡觀察到,，支原體,、病毒污染的確定則一般需借助其他檢測方法。
一,、細(xì)菌污染
細(xì)菌是一類細(xì)胞細(xì)而短（細(xì)胞直徑約0.5 μm,，長度約0.5 ~ 5 μm）、結(jié)構(gòu)簡單,、細(xì)胞壁堅(jiān)韌,、以二等分類方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核微生物。細(xì)菌增殖速度很快,，能短時(shí)間在培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)菌,，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁（有時(shí)靜置的培養(yǎng)基初看不渾濁，但稍加振蕩,，就有很多渾濁物漂起,；有時(shí)在培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)輕微的薄膜或泡沫，或在培養(yǎng)物生長表面出現(xiàn)點(diǎn)狀物,，移動(dòng)培養(yǎng)器皿時(shí)則消散）并變?yōu)辄S色（細(xì)菌污染后大多能改變培養(yǎng)基pH）,。用倒置相差顯微鏡觀察，視野內(nèi)可見點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒,，并可能出現(xiàn)由細(xì)菌遷移引起的閃動(dòng),，一些細(xì)菌會(huì)成團(tuán)或結(jié)合培養(yǎng)的細(xì)胞。
在細(xì)菌污染初期,，若使用了抗生素,，其繁殖處于抑制狀態(tài),，細(xì)胞生長不受明顯影響,，污染情況用倒置相差顯微鏡也不易觀察,、判斷，此時(shí)若懷疑有細(xì)菌污染,，可用無抗生素的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)觀察,。若未使用抗生素，培養(yǎng)液改變不明顯,，但又疑有污染,，可取一份培養(yǎng)基樣本接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)檢測。
需注意細(xì)菌污染有時(shí)可能會(huì)和培養(yǎng)基組分的沉淀或細(xì)胞碎片混淆,，但細(xì)菌形態(tài)一致,，而沉淀或碎片則形態(tài)不同，并且通常大小不一,；細(xì)菌團(tuán)可能與沉淀的蛋白質(zhì)混淆,，但細(xì)菌團(tuán)內(nèi)可見很多單個(gè)或成串的細(xì)菌（特別是晃動(dòng)后），蛋白質(zhì)沉淀則不然,。
細(xì)菌數(shù)量較多時(shí)會(huì)使原先清晰的培養(yǎng)背景變得模糊,，甚至覆蓋培養(yǎng)物，對(duì)培養(yǎng)物的生存構(gòu)成直接的威脅,。迅速增殖的細(xì)菌,，會(huì)消耗營養(yǎng)液和產(chǎn)生毒素從而抑制細(xì)胞生長，毒性大的細(xì)菌會(huì)很快導(dǎo)致細(xì)胞崩解死亡,。
二,、支原體污染
支原體是介于細(xì)菌和病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，無細(xì)胞壁,，形態(tài)多變,，大小介于0.2 ~ 2 μm之間，多吸附在細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間,。不同支原體的生物學(xué)性狀有很大差別,，一般對(duì)熱敏感，對(duì)青霉素普遍有抗藥性,。由于支原體無致死細(xì)胞毒性且可與細(xì)胞長期共存,，故培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，無明顯變化,，或有微細(xì)變化卻由于傳代和換液而被緩解,。除了細(xì)胞培養(yǎng)狀況不佳，采用常規(guī)顯微鏡并不容易觀察支原體污染,，其檢出需借助熒光染色,、PCR,、ELISA、免疫染色,、放射自顯影術(shù),、微生物學(xué)分析等方法，其中采用核酸熒光染料進(jìn)行DNA染色是簡單和最可信的方法之一,。
當(dāng)進(jìn)行熒光染色時(shí),，在40×或100×物鏡下支原體可被顯示為細(xì)胞質(zhì)上明確的微粒或絲狀染色,，一般大小,、性質(zhì)一致，此時(shí)同樣被亮染的培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核可作為陽性對(duì)照,。確定是否存在支原體污染需盡可能多地觀察染色樣本,，因?yàn)椴皇撬信囵B(yǎng)的細(xì)胞都會(huì)被污染。
用熒光染色法進(jìn)行支原體檢測時(shí),，培養(yǎng)物的細(xì)胞碎片可能會(huì)造成假陽性結(jié)果,，但細(xì)胞碎片不會(huì)出現(xiàn)清晰的點(diǎn)狀或絲狀支原體形態(tài)。若仍不能確認(rèn),，可吸取適量待檢培養(yǎng)基與指示細(xì)胞（為已明確無支原體污染且是支原體的適宜宿主,，同時(shí)生長良好，有足夠的細(xì)胞質(zhì)以顯示粘附的支原體,，如MDCK細(xì)胞）共培養(yǎng),，然后熒光染色來觀察指示細(xì)胞表面是否有支原體，從而避免誤判,。
運(yùn)用熒光染色法有時(shí)會(huì)觀察到細(xì)胞質(zhì)存在均勻亮染,，這可能是由RNA引起的，這類熒光會(huì)逐漸變暗,，可將染色樣本干燥避光保存后在第2天觀察,。如果對(duì)熒光檢測的結(jié)果存在懷疑，可重復(fù)檢測或采用其他方法再次檢測,。
支原體可黏附在宿主細(xì)胞表面,，從細(xì)胞膜獲取脂質(zhì)和膽固醇，造成細(xì)胞膜損傷,。支原體能抑制細(xì)胞代謝和生長,，改變核酸合成，影響細(xì)胞抗原性,，導(dǎo)致染色體畸變,，干擾病毒復(fù)制以及具有類似病毒的作用。不同細(xì)胞對(duì)支原體的感受性和反應(yīng)存在差異,。
急性支原體污染可能會(huì)引起培養(yǎng)細(xì)胞狀況的全面惡化,，但很多支原體生長緩慢且不破壞宿主細(xì)胞（特別是連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株）,，它們可通過很多不同的途徑改變培養(yǎng)物的行為和代謝。若細(xì)胞被支原體長期污染,，會(huì)出現(xiàn)增殖減慢,、飽和密度下降等，污染嚴(yán)重的情況下細(xì)胞會(huì)從培養(yǎng)器皿脫落,，另外懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞還會(huì)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,。
三、真菌污染
真菌是一類低等的真核生物,，無法進(jìn)行光合作用，以孢子進(jìn)行繁殖,，一般有發(fā)達(dá)的菌絲體,，異養(yǎng)吸收型，陸生性較強(qiáng),。真菌種類繁多,，形態(tài)各異，若發(fā)生真菌污染,，大多肉眼可見白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)基表面,，短期內(nèi)培養(yǎng)基多不渾濁，某些真菌污染會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH升高,；顯微鏡下觀察,，可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫于細(xì)胞之間,，懸浮在培養(yǎng)液之中,，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生孢子團(tuán)，酵母菌和念珠菌則表現(xiàn)為獨(dú)立的卵圓形顆粒,，并可能出芽,。真菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞,，且會(huì)在培養(yǎng)板孔間蔓延而很快波及鄰孔,。
（細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)常見微生物污染示例（A）培養(yǎng)中的神經(jīng)細(xì)胞被細(xì)菌污染的早期表現(xiàn)，從胞質(zhì)開始出現(xiàn)形態(tài)改變（↑所示）,；（B）桿菌污染的革蘭染色診斷,，▲示革蘭陽性桿菌，Δ示細(xì)胞碎片,；（C）支原體污染的表現(xiàn)之一,，細(xì)胞出現(xiàn)縮和碎片化的改變（↑所示，確診需要結(jié)合分子標(biāo)志物檢測）,；（D）霉菌污染,，硫堇染色,，▲示菌絲，Δ示細(xì)胞碎片,。）
四,、病毒污染
病毒為一種大小以納米計(jì)、不能獨(dú)立地利用外界營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自體繁殖的微生物,。病毒種類復(fù)雜,，相應(yīng)宿主細(xì)胞有特異性，而感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性改變,，因此僅靠目測或顯微鏡觀察不能達(dá)到檢測目的,。應(yīng)根據(jù)不同的病毒選用不同的方法來檢測，常規(guī)有紅細(xì)胞吸附試驗(yàn),、動(dòng)物接種檢查,、電子顯微鏡檢查、免疫學(xué)檢測和PCR等,，因?qū)俨《緦W(xué)的研究范疇,，普通實(shí)驗(yàn)室不易推廣。病毒進(jìn)入細(xì)胞后,，可改變培養(yǎng)物的生物學(xué)性狀,，影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長或干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性。
為杜絕上述污染,，可從以下幾個(gè)方面做好預(yù)防工作：
1,、培養(yǎng)環(huán)境：
1）無菌室：保持清潔，經(jīng)常擦洗,，使污染物不易積聚,。
2）超凈臺(tái)：①定期維護(hù)和保養(yǎng)，按廠家規(guī)定定期清洗和更換空氣濾器,，經(jīng)常保持清潔并用75%乙醇消毒,；②操作前提前30 min啟動(dòng)超凈臺(tái)紫外燈消毒；③存放的物品應(yīng)全面消毒,，并盡可能只將立即使用的物品放入,；④細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)應(yīng)盡量保持層流，避免氣霧狀污染物進(jìn)入培養(yǎng)器皿,；⑤操作中濺出的液體應(yīng)及時(shí)擦去,，并用75%乙醇擦拭消毒；⑥實(shí)驗(yàn)完畢后,，移走所有物品,，并用75%乙醇擦洗工作臺(tái)。
3）二氧化碳培養(yǎng)箱：①由于箱內(nèi)潮濕，溫度適宜,，有利于微生物生長,，故應(yīng)定期對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行清潔和消毒處理。將隔板,、水盤和可拆卸部分取出,，按去污劑擦洗、清水沖洗,、消毒劑擦洗,、紫外線照射30min的順序處理，然后放回箱內(nèi),；②水盤內(nèi)使用滅菌蒸餾水或添加真菌抑制劑如硫酸銅（會(huì)腐蝕不銹鋼等材質(zhì)的水盤）或?qū)Ｓ脺缇?，并注意及時(shí)更換新鮮水；③盡量減少開門次數(shù),，降低污染機(jī)會(huì),；④若取存細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，經(jīng)及時(shí)用75%乙醇擦拭消毒,。
2、物品的消毒滅菌：
①操作前應(yīng)做好所用器皿,、試劑的消毒滅菌工作,；
②高壓蒸汽滅菌是常用的方法，不能采用此法滅菌的器皿,、試劑,，應(yīng)采用其他消毒滅菌方法，如培養(yǎng)基等試劑可過濾除菌,，蓋玻片等器械可用75%乙醇浸泡消毒后置于無菌環(huán)境中晾干,；
③若物品消毒滅菌后長時(shí)間未使用，應(yīng)重新處理,。
3,、個(gè)人衛(wèi)生：
操作前洗凈雙手，操作時(shí)穿清潔的長外衣,，同時(shí)佩戴無菌的手套,、口罩和帽子，手套經(jīng)常用75%乙醇擦拭消毒,。
4,、無菌操作：
防止污染的關(guān)鍵在于嚴(yán)格無菌操作。無菌意識(shí)不強(qiáng),、動(dòng)作不準(zhǔn)確,、操作不熟練等都會(huì)造成污染。注意事項(xiàng)主要如下：
①細(xì)胞培養(yǎng)的操作一定要在超凈臺(tái)等層流裝置內(nèi)進(jìn)行，無菌的試劑,、器械一定要在無菌區(qū)開封,；
②操作時(shí)減少交談、咳嗽等防止來自唾沫和呼出氣流造成的污染,；
③培養(yǎng)試劑不宜過早開瓶,，操作時(shí)應(yīng)盡可能保持瓶體傾斜，所有瓶口不能與超凈臺(tái)的風(fēng)向相逆,，使用后應(yīng)立即封閉瓶口,；
④培養(yǎng)的細(xì)胞處理前也不要過早暴露于空氣中；
⑤不要在打開器皿上方操作,；
⑥不允許用手觸及器皿的無菌部分（如瓶口,、瓶蓋內(nèi)側(cè)）；
⑦吸取液體時(shí)應(yīng)專管專用,，及時(shí)替換,；
⑧若無菌器物的頂端接觸到非無菌物品表面，應(yīng)及時(shí)更換,；
⑨為確保培養(yǎng)物的安全,，應(yīng)盡早凍存有價(jià)值的培養(yǎng)物；
⑩對(duì)新引進(jìn)的細(xì)胞株,、血清等生物材料應(yīng)先隔離培養(yǎng)觀察,，防止外來的污染源。
5,、抗生素：
沒有哪種抗生素都能抑制所有微生物,，即使聯(lián)合使用也難以根chu污染?？股貙?duì)細(xì)胞生長有一定影響,，由抑菌引起的共生現(xiàn)象亦可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)假象；持續(xù)使用會(huì)導(dǎo)致慢性微生物污染（在這種情況下,，微生物被抗生素抑制,，但沒有被殺死，它們會(huì)在培養(yǎng)體系中存留,，大部分時(shí)間檢測不到,，但當(dāng)條件改變時(shí)會(huì)再次出現(xiàn)），同時(shí)還會(huì)使微生物產(chǎn)生抗藥性的幾率大大增加，因此其使用需謹(jǐn)慎，不要讓培養(yǎng)物長期處于抗生素中,。只要操作與條件合格,，最好不添加。