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        PCR引物合成是指通過測定引物的OD值,，溶解引物，最終合成引物的一個完善的過程,。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法,。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效,、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點,。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的,，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接,。

合成四步驟:
　　第一步,
是將預先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯yi酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT,，獲得游離的5′-羥基,。
　　第二步,，
合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體,，與活化劑四氮唑混合,，得到核苷ya 磷酸活化中間體，它的3′端被活化,，5′-羥基仍然被DMT保護,，與溶液中游離的5′-羥基發(fā)生縮合反應。
　　第三步,，
帶帽(capping)反應,，縮合反應中可能有極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應(少于2%)，用yi酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應,，這種短片段可以在后續(xù)環(huán)節(jié)根據(jù)實驗需要來選擇純化方式分離掉,。
　　第四步，
在氧化劑碘的作用下,，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯,。
　
   　經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上,。再以三氯yi酸脫去它的5′-羥基上的保護基團DMT,，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去,。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率,。通過an水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來,，通過OPC, PAGE等手段純化引物,，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀,。沉淀后的引物用水懸浮,，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝,。