日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

        細胞凍存是指將細胞放在低溫環(huán)境,，以達到減少細胞代謝的作用,，從而達到對細胞進行長期儲存進行保種的目的，以供后續(xù)實驗或臨床使用。細胞凍存一般采用慢凍原則,，慢凍可使細胞逐步脫水,，細胞不會因為產(chǎn)生大的冰晶而收到損害,。

一、原理

當溫度低至-70℃時,，細胞內(nèi)的代謝活動及酶活性幾乎全部停止,，低于-130℃時,，細胞能達到最佳存活率。液氮可實現(xiàn)細胞的長期保存,。

冷凍保護劑二甲基亞砜（DMSO）能快速穿透細胞膜進入細胞,，降低冰點,，延緩凍存過程，同時增加細胞膜的通透性,，提高細胞內(nèi)離子濃度,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成,，從而達到保護細胞的目的。

二,、貼壁細胞凍存操作步驟

1、預熱凍存液；

2、用PBS沖洗細胞,，加入胰酶消化（此步驟同細胞傳代操作）,；

3,、終止消化后,，重懸細胞，轉(zhuǎn)移至無菌EP管，1000rpm離心5min；

4,、棄上清,，加入預熱的細胞凍存液，細胞凍存最佳密度為5×10^6~1×10^7/ml,，一般不低于5×10^5/ml,；

5、分裝完畢后,，擰緊凍存管蓋并做好標記,；

6、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱過夜,；

7、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存,。

三,、懸浮細胞凍存操作步驟

1、用移液管將細胞懸液吹吸均勻,，將細胞懸液移入離心管,；

2、1000rpm離心 3 min,，收集細胞沉淀,；

3、用預熱的凍存液重懸細胞,，細胞凍存最佳密度為3-5×10^6/ml,，一般不低于5×10^5/ml；

4,、分裝完畢后,，擰緊凍存管蓋并做好標記；

5,、將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒,，放入-80℃冰箱過夜；

6,、將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存,。

貼壁細胞凍存操作示意圖

注意事項：

①　細胞培養(yǎng)、傳代以及凍存需要嚴格的無菌操作,。

②　傳代時需要適度的消化,，消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化,，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散,，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化,。

③　傳代應在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行,。

④　細胞凍存液需提前配制,，不可直接將DMSO加入細胞懸液中。

⑤　應選擇匯合度80%-90%左右,，并且活力達90%以上處于對數(shù)生長期時的細胞進行凍存操作,，確保細胞凍存時狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整,。

⑥　程序凍存盒,、細胞凍存液、全培養(yǎng)基等試劑都要復溫至室溫備用,。

⑦　凍存前注意切勿消化時間過長,、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長,，以免造成細胞損傷,。

⑧　凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復蘇時水會滲入造成污染,。

⑨　細胞不可長期保存在-80℃冰箱中,，放置時間不要超過3天,。

⑩　液氮或冰箱距離細胞房較遠,，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。