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蛋白質(zhì)鹽析法全方面分析
閱讀：482 發(fā)布時間：2024-5-13蛋白質(zhì)通過鹽析的辦法沉淀的原理是降低蛋白質(zhì)的溶解度,，使蛋白質(zhì)凝聚而從溶液中析出,。一般來說，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,，這一過程叫鹽析,。在生化制備中,許多物質(zhì)都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離，如蛋白質(zhì),、多肽,、多糖、核酸等,，其中以蛋白質(zhì)沉淀最為常見，特別是在粗提階段,。
鹽析法分為兩類,，第一類叫Ks分段鹽析法，在一定PH和溫度下通過改變離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn),，用于早期的粗提液,；第二種叫b分段鹽析法，在一定離子強(qiáng)度下通過改變PH和溫度來實(shí)現(xiàn),，用于后期進(jìn)一步分離純化和結(jié)晶,。
一．影響鹽析的若干因素
1．蛋白質(zhì)濃度
高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質(zhì)的b 和Ks常數(shù)十分接近,，若蛋白濃度過高,，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析,，所用的鹽量較多,，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇,。用于分步分離提純時,，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液,，多加一點(diǎn)中性鹽，使共沉淀作用減至低限度,。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中,。
2．離子強(qiáng)度和類型
一般說來，離子強(qiáng)度越大,，蛋白質(zhì)的溶解度越低,。在進(jìn)行分離的時候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行,。每一組分被鹽析出來后,，經(jīng)過過濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度,，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來,。
離子種類對蛋白質(zhì)溶解度也有一定影響，離子半徑小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強(qiáng),，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱,，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂。
3．PH值
一般來說,，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大,，凈電荷越少溶解度越小，在等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)溶解度最小,。為提高鹽析效率,，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的,，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整溶液PH值,，以達(dá)到*好的鹽析效果。
4．溫度
在低離子強(qiáng)度或純水中,，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加,。但在高濃度下，蛋白質(zhì),、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降,。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,，可在室溫下進(jìn)行,，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。
二．硫酸銨的使用
硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用,，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和,，放置過夜,，用濾紙除去重金屬離子,，濃縮結(jié)晶，100℃烘干后使用,。另外,，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用an水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH,。
硫酸銨的加入有以下幾種方法：
1）,、加入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；
2）,、加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況,；
3）、透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中,，然后浸入飽和硫酸銨中進(jìn)行透析,，透析袋內(nèi)硫酸銨飽和度逐漸提高，達(dá)到設(shè)定濃度后,，目的蛋白析出,，停止透析。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性,，鹽析效果好,，但手續(xù)煩瑣，需不斷測量飽和度,，故多用于結(jié)晶,，其它情況少見。
使用固體硫酸銨注意事項(xiàng)：
1）,、必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度,，一般有0℃或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中,；
2）、分段鹽析中,，應(yīng)考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化,。一種蛋白質(zhì)如經(jīng)二次透析，一般來說,，第一次鹽析分離范圍（飽和度范圍）比較寬,，第二次分離范圍較窄。
3）,、鹽析后一般放置半小時至一小時,，待沉淀全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液,，因?yàn)榇朔N情況下,，硫酸銨密度較大,，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能,。離心多用于低濃度硫酸銨溶液,。