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ELISA免疫檢測顯色與比色詳情
閱讀：143 發(fā)布時間：2024-4-22酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,，ELISA）是免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術ELISA檢測是一種免疫檢測方法,，通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白,。像其他免疫檢測法一樣,，它們依靠抗體與目標的結合來促進檢測。
一,、顯色
ELISA試劑盒里的顯色液A和B成分：
如果你是HRP的二抗,，顯色液A、B的成分一般是H2O2和TMB（或OPD）,，至于具體A是那一個B是那一個你要看說明書,。
HRP催化過氧化物H2O2，其反應式如下：D＝TMB（或OPD）
DH2+ H2O2＝ D+2H2O
上式中,，DH2為供氧體,，H2O2為受氫體。在ELISA中,，DH2一般為無色化合物,，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定,。
顯色是ELISA中的后一步溫育反應,，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素,。在一定時間內(nèi),，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強,。
適當提高溫度有助于加速顯色進行,。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確,。定性測定的顯色可在室溫進行,，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間,，及時判斷,。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高,。OPD底物液受光照會自行變色,，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應,。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,，顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,，可在室溫中置于操作臺上,，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性,，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果,。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達,，隨即逐漸減弱,，至2小時后即可消退至無色,。
TMB的終止液有多種,，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,，是目視判斷的良好終止劑,。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值,。
二、比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中,。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中,，才可進行比色,。
在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈,，這樣,，此板就可*平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點,，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔),，以記錄本次試驗的試劑狀況。
其后可用空白孔以蒸餾水校零點,，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,，然后進行計算。
比色結果的表達以往通用光密度(oplical density，OD),，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence,，A)，兩者含義相同,。通常的表示方法是,，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm,，表示方法為"A492nm"或"OD492nm",。