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ELISA試驗(yàn)操作過(guò)程注意點(diǎn)匯總
閱讀：188 發(fā)布時(shí)間：2024-4-1ELISA技術(shù)原理將抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù),，利用酶標(biāo)技術(shù)標(biāo)記抗原或抗體，通過(guò)顯色反應(yīng),，用以檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原,，對(duì)其進(jìn)行定性或定量分析,。
ELISA實(shí)驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用,，但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大,，如不注意，有可能導(dǎo)致顯色不全,、花板等結(jié)果,。下面一步步分析ELISA試驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果因素。
1,、標(biāo)本的選擇與準(zhǔn)備
用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本最為常用的是血清(漿),，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的，也用到唾液,、腦脊液,、尿液、糞便等標(biāo)本,。目前臨床上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物、激素,、特種蛋白,、細(xì)胞因子和治療藥物等。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集,，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響,。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素,、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性方式釋放,，因此，在測(cè)定此類(lèi)激素時(shí),，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本,，以其中間值為測(cè)定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí),，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高,。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的最適時(shí)間抽血檢測(cè),。用于傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒(méi)有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：
(1),、要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性,，因此,，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中,，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相,，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色,。
(2)、樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染,，一則細(xì)菌的生長(zhǎng),，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
(3),、血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離,，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作,，則建議冰凍保存,。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下,。
(4),、冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融,。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，從而引起假陰性結(jié)果。此外,，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可,。
(5),、標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè),。
2,、試劑的準(zhǔn)備
在實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意,，通常的做法是,，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題,，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性,。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備最為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái),，在室溫下放置30-60分鐘，再進(jìn)行測(cè)定,，以使試劑盒在使用前與室溫平衡,。這樣做的目的,，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度,，以滿足測(cè)定要求,。
3、加樣
（1）,、標(biāo)本為血清：最好將血液先自然存放1-2小時(shí)后,，再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次,，放置一段時(shí)間后,，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測(cè)，可放在2-8℃冰箱中,，若要貯存,，則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。
（2）,、加樣后及時(shí)放入孵箱,。
（3）、加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干,。
（4）,、如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑,。
（5）,、標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作,。
（6）,、血清樣本的加入幾乎是唯1的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部,，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染,。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。
4,、孵育
（1）,、溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結(jié)合,，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比,，即溫度越高,，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫,，其次是43℃和2～8℃,。按照操作說(shuō)明嚴(yán)格控制孵育時(shí)間；
（2）,、孵育時(shí)貼封片或加蓋,，避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁,。
5,、洗板
保證洗液注滿各孔，洗板針暢通,，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈,、無(wú)或少塵的吸水材料)上輕輕拍干;反應(yīng)板過(guò)多時(shí)，合理安排,，或多用幾臺(tái)洗板機(jī),，避免等待時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
6,、 顯色
顯色劑盡量在臨用前配制,，堅(jiān)持不用過(guò)期顯色劑，肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用; 加樣時(shí)保持顯色劑不外流,。
7、 終止
在加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,，而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,。
8、讀板
整個(gè)操作過(guò)程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸;盡可能實(shí)現(xiàn)ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化,，有效提高檢測(cè)質(zhì)量,。
在實(shí)際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外,，必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作,，同時(shí)作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評(píng),，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測(cè)每一份標(biāo)本,，才能保證檢測(cè)質(zhì)量。