日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

PCR引物設(shè)計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段,，使其能有效地擴增模板DNA序列,。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否,。

要設(shè)計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū),。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu),，就要避開它,。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計引物,。

現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計一對引物,。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對,。讓我們先看看P1引物,。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機,。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在,。否則P1引物設(shè)計的就不合理。應重新尋找區(qū)域設(shè)計引物,。

同時引物之間也不能有互補性,，一般一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的互補。

引物確定以后,，可以對引物進行必要的修飾,，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素,、熒光素等,，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾,，因為引物的延伸是從3′端開始的,。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并,，會影響擴增的特異性與效率,。

①引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。

②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu),。

③引物長度一般在15~30堿基之間,。

④G+C含量在40%~60%之間。

⑤堿基要隨機分布,。

⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補,。

⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

⑧引物5′端可以修飾,。

⑨引物3′端不可修飾,。

⑩引物3′端要避開密碼子的第3位,。

PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列,。如前述,，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功,，但遵循某些原則,，則有助于引物的設(shè)計。

1.  引物的特異性

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源,。

2.  避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)

某些引物無效的主要原因是引物重復區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響,，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機軟件可以預測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu),，有助于選擇模板,。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G°）小于58.6 lkJ/mol時,，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時,，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的,。

3.  長度

寡核苷酸引物長度為15~30 bp，一般為20~27mer,。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T+,，Ln值不能大于38，因為>38時,，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性,。

4.  G+C含量

G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,，即在一定鹽濃度條件下,，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度,，一般高于Tm值5~10℃,。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃,，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳,。

5.  堿基礎(chǔ)隨機分布

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在,。尤其3′端不應超過3個連續(xù)的G或C,，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

6.  引物自身

引物自身不應存在互補序列,，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復性,。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合,。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp,。

7.  引物之間

兩引物之間不應不互補性,，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性,。

8.  引物的3′端

引物的延伸是從3′端開始的,，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能,，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中,，引物3′端不能發(fā)生錯配。

在標準PCR反應體系中,，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板,，按95℃，25s,；55℃,，25s；72℃,，1min的循環(huán)參數(shù)擴增HIV-1gag基因區(qū)的條件下,，引物3′端錯配對擴增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至1/20,，A∶G和C∶C錯七下降至1/100,。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。

9.  引物的5′端

引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度,，它對擴增特異性影響不大,。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性,。引物5′端修飾包括：加酶切位點,；標記生物素、熒光,、Eu3+等,；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點,、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等,。

10.  密碼子的簡并

如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位,，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,，會影響擴增特異性與效率。