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細(xì)胞培養(yǎng)用液具體步驟
閱讀：109 發(fā)布時間：2024-2-5器材與試劑：
干粉型培養(yǎng)基,、胰蛋白酶，青霉素,、鏈霉素.純凈水系統(tǒng),、電子天平,、PH計,、磁力攪拌器。
具體步驟：
一,、水的制備：
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水,、三蒸水或純凈水.
二,、PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks,，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：將藥品（NaCl8.0g,，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g,，KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中,，玻璃棒攪動，充分溶解,，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml,，搖勻即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi),，蓋上膠帽,，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘,。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。
三,、胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散,。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度,、溫度和作用時間有關(guān),，在pH為8.0、溫度為37℃時,，胰酶溶液的作用能力強(qiáng),。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度,、溫度和時間,，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+,、Mg2+和血清,、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+,、Mg2+的BSS,，如：D-Hanks液。終止消化時,，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用,。
1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中,。攪拌混勻,，置于4℃內(nèi)過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌,。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用,。
四、青,、鏈霉素溶液的配制于消毒
1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌,。
2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶,，用注射器加4ml滅菌雙蒸水,。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水,，即每毫升各為20萬單位,。
3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml,。1單位＝1微克
五,、RPMI1640的制備與消毒：
1.溶解,、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml,。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右,。最后定容至1000ml，搖勻,。
2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架,，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好,。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒,。
3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾,。
4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用,。
5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。
六,、血清的滅活：
細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清,，新買來的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用,。
七,、HEPES溶液：
HEPES的化學(xué)全稱位羥乙ji呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid）。對細(xì)胞無毒性作用,。它是一種氫離子緩沖劑,，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L,，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力,。
1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：
準(zhǔn)確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L,。過濾除菌，分裝后4℃保存,。
注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶,，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20mmol/L,。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中,，過濾除菌后可全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可,。
八,、谷氨酰胺：
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要,，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡,。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,，4℃下放置1周可分解50％,，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存,，用前加入培養(yǎng)液,。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺,。
一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L,。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存,，用時加入培養(yǎng)液,。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶,，-20℃保存,，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九,、肝素溶液的配制：
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高,，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉,，包裝為約為0.56克/瓶,，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中,，定容,，過夜，然后過濾除菌,，分裝小瓶,，保存溫度為--℃。使用時,，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可,。
十、Ⅰ型膠原酶：
0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌,。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大,，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌,。分裝入10ml小瓶-20℃保存,。
十一,、明膠溶液：
因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制,。所以制備過程中必須要注意無菌操作,。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1%的溶液,，明膠也難溶,，因此要充分搖勻，過夜放置,，然后無菌分裝入50ml小瓶中,，4℃保存。
十二,、其他培養(yǎng)用液的配制：
20ug/ml內(nèi)皮生長因子
注意事項：
1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水,。
2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方,，并且要特別注意濾膜光面朝上,。
3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性,，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2,，可在配制時調(diào)PH至7.4。