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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)實(shí)驗(yàn)步驟詳述
閱讀：416 發(fā)布時間：2024-1-22 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板,，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá),。
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、總RNA的提取
總RNA提取可以：（1）獲得高純度,、高質(zhì)量的總RNA,；（2）可以滿足生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)Northern Blot、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn),、RT-PCR,、qRT-PCR 和陣列分析所需。
二,、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例,。
1． 在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg,，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11 μl,。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，輕輕混勻,、離心,；
2．70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min,；
3． 取0.5 ml PCR管,，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl,；下游引物（10 pM） 2 μl,；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl,；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl,。輕輕混勻,，離心。42℃孵育2-5 min,；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ,，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加熱15 min以終止反應(yīng),；
6．將管插入冰中,，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min,，降解殘留的RNA,。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管,，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl,；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl,；dNTP(2 mM) 4 μl,；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl,；
2．加入適量的ddH2O,，使總體積達(dá)50 μl。輕輕混勻,，離心,；
3．設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個循環(huán),。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確,，可在PCR擴(kuò)增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物,，同時擴(kuò)增內(nèi)參DNA,，作為對照；
4．電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳,，紫外燈下觀察結(jié)果,；
5．密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng),，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。
注意事項(xiàng)：
1．在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,；
2． 為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對照,；
3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動蛋白）等,。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；
4． PCR不能進(jìn)入平臺期,，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列,、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定,；
5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。