日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

 總RNA提?。?/strong>

A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小,，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿,。每30-50mg組織加1ml Trizol,。

B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min,，室溫3500rpm離心6min,。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol,。

C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長(zhǎng)的細(xì)胞,，通過(guò)離心收集細(xì)胞后，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol,，移液器吹打混勻,，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,，有兩種處理方法,。一種是移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞,?；蚴窍扔靡鹊鞍酌笇①N壁細(xì)胞消化下來(lái)并收集后，再加入1mL Trizol進(jìn)行裂解,。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基,。）熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟如下：

1、直接法

1）加入1ml Trizol試劑,，混勻,，冰上孵育10min。

2）4℃，12000rpm離心10min,，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中,。

3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒,，室溫孵育5min,。

4）4℃，12000rpm離心15min,?；旌弦悍秩龑樱ㄗ钕旅娴谋椒?- 氯仿有機(jī)相,，中間相和上層水相,。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相,，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要！）

5）加入等體積的異丙醇,，輕輕地顛倒混勻約10次,，室溫放置10min。

6）4℃,，12000rpm離心10min,。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次,。

7）4℃,，12000rpm離心5min，棄上清,，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干,，過(guò)度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解！）,。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中,。

8）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存,。

2,、離心柱法(依據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū))

1）1、中步驟1）—4）,。

2）加入1/2體積的無(wú)水乙醇,，輕柔顛倒混勻。如有透明的纖維狀物體,，不影響下游步驟,。

3）將所有裂解物/乙醇混合物轉(zhuǎn)移至離心柱,，置于2mL，靜置2min,。4℃,，12000rpm離心3min，棄廢液,。

4）加入500uL洗滌液,，靜置2min。4℃,，12000rpm離心30秒，棄廢液,。重復(fù)一次,。

5）4℃，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇,。

6）將離心柱置于新的RNase-free EP管中,，加入30ul-50ulDEPC水，靜置5min,， 12000rpm離心2min收集,。

7）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長(zhǎng)期保存,。