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 總RNA提?。?/strong>

A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小,，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解,，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿,。每30-50mg組織加1ml Trizol,。

B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中,，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min,。棄上清,，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

C細(xì)胞樣品：懸浮液中生長的細(xì)胞,，通過離心收集細(xì)胞后,，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻,，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月,。貼壁生長的細(xì)胞，有兩種處理方法,。一種是移除培養(yǎng)基后,，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞?；蚴窍扔靡鹊鞍酌笇①N壁細(xì)胞消化下來并收集后,，再加入1mL Trizol進(jìn)行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基,。）熒光定量PCR(SYBR Green)總RNA提取方法步驟如下：

1,、直接法

1）加入1ml Trizol試劑，混勻,，冰上孵育10min,。

2）4℃，12000rpm離心10min,，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中,。

3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒,，室溫孵育5min,。

4）4℃，12000rpm離心15min,?；旌弦悍秩龑樱ㄗ钕旅娴谋椒?- 氯仿有機(jī)相,，中間相和上層水相,。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol）,，不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要?。?/span>

5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次,，室溫放置10min,。

6）4℃，12000rpm離心10min,。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次,。

7）4℃,，12000rpm離心5min，棄上清,，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干,，過度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解！）,。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中,。

8）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長期保存,。

2,、離心柱法(依據(jù)RNA提取試劑盒說明書)

1）1、中步驟1）—4）,。

2）加入1/2體積的無水乙醇,，輕柔顛倒混勻。如有透明的纖維狀物體,，不影響下游步驟,。

3）將所有裂解物/乙醇混合物轉(zhuǎn)移至離心柱，置于2mL,，靜置2min,。4℃，12000rpm離心3min,，棄廢液,。

4）加入500uL洗滌液，靜置2min,。4℃,，12000rpm離心30秒，棄廢液,。重復(fù)一次,。

5）4℃，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇。

6）將離心柱置于新的RNase-free EP管中,，加入30ul-50ulDEPC水,，靜置5min， 12000rpm離心2min收集,。

7）立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),，或先-80℃長期保存。