化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
細胞冷凍保存方法?及注意事項
閱讀：366 發(fā)布時間：2023-9-11冷凍保存方法：
1,、傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存,。
-20℃不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大,，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些,。
2,、程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存,。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存,。
3、步驟：
（1）冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基,，使細胞處于指數(shù)生長期,。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基,、血清,，逐滴加入二甲基亞砜（DMSO）至20%濃度，即制成雙倍的凍存液,，置于室溫下待用,。
（3）離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞,，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率,。
（4）取與細胞懸液等量的凍存液,，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管,，制成細胞凍存懸液（DMSO最后濃度為5～10％）,，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻,，分裝于已標示全之冷凍保存管中,，1～2ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測,。嚴密封口后,，注明細胞名稱、代數(shù),、日期,。然后進行凍存,。
注意事項：
（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),，約為80～90％致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其te有性質(zhì),，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生,。
（2）細胞在液氮中可長期凍存無限shi間，而不會影響細胞活力,；在-70度可保存數(shù)月,。
（3）注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應為試劑級等級,，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝,，4℃避光保存,，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性,。本方法中先制備雙倍凍存液,，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲,，可降低細胞受損,。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存,。
（4）冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml,，細胞濃度不要太高,，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死qu。
③adherent tumor lines:5～7×106,，依細胞種類而異,。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml,，human lymphocyte須至少5×106cells/ml,。
（5）冷凍保護劑濃度為5或10％DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。
（6）,、凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力,，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積（4度時）,，復蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養(yǎng)細胞,，以90%血清凍存更為有效,。