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ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)包被過程詳解
閱讀：926 發(fā)布時(shí)間：2023-8-28 在使用ELISA試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候,，需要注意很多問題,，比如溫育、顯色,、包被等問題,。其中，包被是要特別注意的一個(gè)問題,，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的效果,。
一、 包被的方式
將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating),。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的,，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的,，受蛋白質(zhì)的分子量,、等電點(diǎn)、濃度等的影響,。
大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán),，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用,，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,。
親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA,，ELISA試劑盒這種包被方法均勻,、牢固,，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定,。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合,，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中,，開蓋置冰箱或冷風(fēng)吹干,，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面,。
優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性,、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳,。抗原用量少,，僅為直接包被的1/10乃至于/100,。
二、包被用抗原
天然抗原,、重組抗原和合成多肽抗原三大類,。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇,，純度高,，特異性也高，但由于分子量太小,，往往難于直接吸附于固相上,。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面,。
三,、包被用抗體
IgG對聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力,，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上,，ELISA試劑盒抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA,，以保證試驗(yàn)的特異性,。
腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng),，因此不需要作吸收層析處理,，直接包被。在某些情況下,，用多種單抗混合包被,，可取得更好的效果。
四 ,、包被的條件
pH9.6碳酸鹽緩沖液
pH7.2的磷酸鹽緩沖液
pH7-8的Tris-HCL緩沖液
加入包被液后,，在4-8℃冰箱中放置，37℃中保溫2小時(shí),。ELISA試劑盒包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml,。