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PCR的概念:

PCR,，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,，PCR），主要由高溫變性,、低溫退火和適溫延伸三個(gè)步驟反復(fù)的熱循環(huán)構(gòu)成：即模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條引物分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火,，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）為底物,，使退火引物得以延伸，如此反復(fù),，使位于兩段已知序列之間的DNA丨片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增,。

 PCR的分類:

PCR有很多種，核心就是用引物擴(kuò)增特定的DNA,，以指數(shù)方式倍增的DNA達(dá)到可以觀察到的量后,，通過不同的觀察方法比較DNA相對(duì)表達(dá)的高低。根據(jù)檢測(cè)方式的不同,，分為終點(diǎn) PCR（也即常規(guī)PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）,根據(jù)樣本類型的不同,，還包括以RNA為模板的反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR,，RT-PCR）。

終點(diǎn)PCR,，顧名思義既是對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定性及定量分析,，在反應(yīng)過程中無法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行情況，只有反應(yīng)完成后通過跑膠得到結(jié)果,。

1.熱啟動(dòng)PCR（hot start PCR）

在傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)中,，反應(yīng)體系各成分（Taq DNA聚合酶,、dNTP 和引物等）均是一次加入并進(jìn)入循環(huán)，在反應(yīng)溫度由室溫（25℃）上升至高溫（94～95℃）過程中,，可能發(fā)生引物錯(cuò)配和二聚體的形成,。引物與模板中一些非靶位點(diǎn)的錯(cuò)配和引物之間形成的二聚體，在Taq酶的作用下均可延伸,，這些非特異性產(chǎn)物又可以在后面的PCR循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增,，使非特異性產(chǎn)物不斷積累，同時(shí),，也消耗反應(yīng)體系的各成分,，最終PCR擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物大大減少。熱啟動(dòng)PCR(hot start PCR)是指DNA聚合酶只有在樣品溫度至少超過70℃時(shí)才發(fā)揮作用的PCR,。通過這種方式控制PCR反應(yīng)的必須組分DNA聚合酶,，直到反應(yīng)混合物被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚合的溫度后，再啟動(dòng)PCR達(dá)到有效擴(kuò)增特異性PCR產(chǎn)物的目的,。

UNG酶通常和熱啟Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染體系的熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)系統(tǒng),。

UNG酶(Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶)的作用原理是選擇性水解斷裂含有dU的雙鏈或單鏈DNA中的尿嘧啶糖苷鍵,，形成的有缺失堿基的DNA鏈在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂,，從而被消除。UNG酶的最佳活性溫度為50℃,，95℃滅活,。作用：為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染,。常用的措施是使用UNG酶（Uracil-N-Glycosylase）和Taq 酶熱啟動(dòng),。PCR反應(yīng)常見，最重要的污染物是PCR產(chǎn)物,，防污染熱啟動(dòng)PCR試劑盒以dUTP取代dTTP,，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在PCR開始前增加50℃的保溫步驟,，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解,，并在隨后變性這步的條件下DNA鏈斷裂，消除由于污染DNA產(chǎn)生的擴(kuò)增,，從而保證擴(kuò)增結(jié)果的特異性,，準(zhǔn)確性。

2.高保真PCR

Taq酶具有5'-3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性,，缺少3'→5'的外切酶活性,，但沒有從3'→5'方向外切酶的活性，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的3'末端附有一個(gè)“A"堿基,，可直接用于TA克隆,，但是由于不具有3'→5'外切酶活性,，因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒有校正功能。DNA聚合酶的校正能力決定了保真度,，會(huì)影響DNA序列復(fù)制的準(zhǔn)確性,。Solis Biodyne提供的blend mix同時(shí)包含Taq酶和校正酶，使得PCR反應(yīng)既具有5'→3'方向合成DNA的功能,，又具有3'→5'方向外切酶的活性和糾錯(cuò)功能,。

3.多重PCR

多重PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的 PCR反應(yīng),。多重PCR不僅意味著節(jié)省時(shí)間,、試劑和樣品，還能夠同時(shí)對(duì)比多個(gè)擴(kuò)增子,。

在多重PCR中,，因無法僅針對(duì)一個(gè)引物對(duì)或目的片段進(jìn)行反應(yīng)優(yōu)化，而是要考慮到所有引物和靶標(biāo),，所以可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和效率降低,。因此，為盡量減少由非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的錯(cuò)配,，應(yīng)對(duì)引物進(jìn)行精心設(shè)計(jì),。首先，引物序列應(yīng)盡可能與其目的序列一一對(duì)應(yīng),，并且所有引物的 Tm相差不應(yīng)超過5°C,。其次，在多重PCR開始前,，應(yīng)利用單個(gè)PCR反應(yīng)驗(yàn)證每個(gè)引物對(duì)的特異性和擴(kuò)增效率,。此外，擴(kuò)增子應(yīng)具有不同的大小,，從而能夠通過凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行分離鑒定,。

4.長片段PCR

常規(guī)PCR反應(yīng)可以擴(kuò)增到3~4kb的DNA丨片段，而超過5kb的DNA丨片段就已經(jīng)很難擴(kuò)增出來了,。長片段PCR即是指擴(kuò)增大于5kb的DNA丨片段,。NCBI推薦的基因克隆供應(yīng)商GeneCopoeia可提供長片段PCR試劑盒，可擴(kuò)增18kb人來源gDNA以及30kb λ噬菌體DNA為模板等大片段DNA,，同時(shí)可擴(kuò)增高GC%片段,，適用范圍廣，實(shí)驗(yàn)過程中僅需添加引物與模板,，操作簡便。

5.高GC含量PCR

在DNA（A,、T,、C,、G）4種堿基中，鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率稱為GC含量,。因?yàn)镚,、C之間形成三對(duì)氫鍵，解鏈所需能量較高,，所以模板很難打開,，高GC含量（G+C≥60%）模板擴(kuò)增中所面臨的主要困難是模板中容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)妨礙DNA聚合酶在模板上的推進(jìn)，而且模板上可能存在多個(gè)非特異性的引物復(fù)性位點(diǎn),，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,，甚至很多時(shí)候擴(kuò)增不出靶基因。Solis BioDyne可專業(yè)提供專業(yè)的高GC含量模板的PCR增強(qiáng)劑和預(yù)混液,，可適用于GC含量高至79%的模板,，輕松解決高GC含量PCR的難題。