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PCR設(shè)計(jì)引物需考慮問題匯總
閱讀：381 發(fā)布時(shí)間：2023-5-15在整個(gè)PCR體系中,，引物占有十分重要的地位,。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的的DNA結(jié)合,，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進(jìn)行有效的延伸,，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。PCR設(shè)計(jì)引物需考慮問題匯總：
1．酶切位點(diǎn)
兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)是載體上的,，所連接片斷上沒有這兩個(gè)位點(diǎn),，且距離不能太近，否則往往導(dǎo)致兩個(gè)酶都切不好,。因此,，兩個(gè)酶切位點(diǎn)要緊挨在一起,，只能切一個(gè)，除非恰好是與上面兩個(gè)酶在一起的酶切位點(diǎn),，最好隔四個(gè)核苷酸,。且不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG,，這樣的位點(diǎn)比較難切,。
2．酶的選擇
最好使用雙酶切效率高的，但兩個(gè)酶切點(diǎn)最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補(bǔ)）,，否則效果相當(dāng)于單酶切,，最好使用具有共同buffer，且較常用的酶（如hind3,，bamh1,，ecor1等），這樣可以省錢,。
3．Tm的計(jì)算,。
Tm是由互補(bǔ)的DNA區(qū)域決定的，而不互補(bǔ)的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的,。因此,，對于引物的Tm，只有和模板互補(bǔ)的區(qū)域?qū)m才有貢獻(xiàn),。計(jì)算Tm時(shí),，只計(jì)算互補(bǔ)的區(qū)域（除非你的酶切位點(diǎn)也與模板互補(bǔ)）。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候,，先不管5'端的修飾序列,，把互補(bǔ)區(qū)的Tm控制在55度以上（我喜歡控制在58以上，具體根據(jù)PCR的具體情況,，對于困難的PCR,，需要適當(dāng)提高Tm），再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基,，這樣的引物通常都是可用的,，即使有小的問題，也可以挽回,。
Tm溫度高的引物就比較容易克服3’發(fā)卡,、二聚體及3'非特異結(jié)合等問題。簡單的計(jì)算公式可以用2+4的公式,。若你計(jì)算的Tm值達(dá)到了快90 ,，不包括酶切位點(diǎn)。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點(diǎn)的。自己可以再估計(jì)一下,。如你設(shè)計(jì)了帶酶切位點(diǎn)的引物，總長分別為29,、33個(gè)堿基,，去掉酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，分別為17,、21個(gè)堿基,。引物公司給的單子是70多度，實(shí)際用的只有50度,，用55度擴(kuò)的結(jié)果也差不多,。
其它關(guān)于Tm值的計(jì)算，有用PP5.0進(jìn)行評價(jià)的,，需要考慮base number,、GC%、Tm,、hairpin,、dimer、false priming,、cross dimer等參數(shù),。
4．退火溫度
退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計(jì)算可以不把加入的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基考慮進(jìn)去,， PCR幾個(gè)循環(huán)后,，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴(kuò)增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步,，溫度比你Tm值低些（這樣可能會(huì)增加非特異性）,，Tm值是你包括酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的Primer計(jì)算出來的。
5．5’端保護(hù)堿基
一般在5'端加保護(hù)堿基,如果你擴(kuò)增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話,酶切時(shí)可以不需加保護(hù)堿基
6．引物二聚體
關(guān)于引物二聚體,，最好用primer或是其他設(shè)計(jì)引物的軟件進(jìn)行計(jì)算一下,，看看引物之間的△G（自由能）的絕對值，如果小于10,，一般是問題的,。如果稍大，PCR時(shí)可以提高一下退火溫度,，一般是沒有問題的,。如果3’端形成二聚體，并且自由能絕對值較大,，如果 PCR沒有條帶,，建議重新設(shè)計(jì)引物。此外，所加的三個(gè)核苷酸的保護(hù)序列經(jīng)過盡心設(shè)計(jì)有時(shí)也可以降低二聚體的△G,。
7．引物的設(shè)計(jì)
在設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí),，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因?yàn)?，一個(gè)特異性引物一般都是20bp左右,，再加上酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)性堿基，大致就是28bp左右了,。而我們在設(shè)計(jì)退火溫度時(shí),，與引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm肯定要高一些,。如果我們能利用引物自身的部分序列,，就可以有效地減少引物的長度。
還有,，有些酶是離不開末端序列的,，因此，在設(shè)計(jì)一個(gè)酶位點(diǎn)時(shí),，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚,。設(shè)計(jì)時(shí)限制性酶切位點(diǎn)是應(yīng)該在5’端的頂端。在設(shè)計(jì)引物時(shí),，常在5’端添加酶切位點(diǎn),，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。
設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T,。先用軟件設(shè)計(jì)出合適的引物,，引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對,，應(yīng)盡量避免在引物3’端的第1位堿基是A（容易錯(cuò)配）,。引物3’端最佳堿基的選擇是G和C，因?yàn)樗麄冃纬傻膲A基配對比較穩(wěn)定,。目的序列上并不存在的,。