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有關?PCR反應原理詳解
閱讀：446 發(fā)布時間：2023-3-13PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈,，以便它與引物結合,，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,，以dNTP為反應原料,，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝,。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升,。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算,。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率,，n代表循環(huán)次數,。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值,。反應初期,，靶序列DNA片段的增加呈指數形式,，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加,，而進入線性增長期或靜止期,，即出現“停滯效應"，這種效應稱平臺期數,、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素,。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的,。
PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分,。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5’端之間，是需要擴增的特定片段,。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的,，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中,，以兩條互補的DNA為模板,，引物是從3’端開始延伸，其5’端是固定的,，3’端則沒有固定的止點,，長短不一，這就是“長產物片段",。進入第二周期后,，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段")結合,。引物在與新鏈結合時,，由于新鏈模板的5’端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點,，保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內,、形成長短一致的“短產物片段"。不難看出“短產物片段"是按指數倍數增加,，而“長產物片段"則以算術倍數增加,，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應產物不需要再純化,，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用,。