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論述ELISA常見檢測方法
閱讀：394 發(fā)布時(shí)間：2022-10-24ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù),。在檢測時(shí),，受檢標(biāo)本（測定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體,，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體,。ELISA的檢測方法有直接發(fā),、間接法、競爭法基雙抗夾心法四種常見ELISA方法,，其中直接法和競爭法應(yīng)用較少，應(yīng)有最多的是雙抗夾心法,，其在敏感性基因特異性上有明顯的優(yōu)勢,。
1. 直接ELISA
將抗原固定于ELISA板上,，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。
相較于其它類型的ELISA實(shí)驗(yàn),，直接ELISA實(shí)驗(yàn)步驟少,，檢測速度快,，不需要用到二抗,，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯(cuò),。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的,，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與ELISA板結(jié)合,，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗,，實(shí)驗(yàn)不太靈活,。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大,，降低了測定的靈敏度。
2. 間接ELISA
先將抗原結(jié)合到ELISA板上,，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合,，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。
與直接ELISA相比,，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度,，也需要更少的標(biāo)記抗體,，更經(jīng)濟(jì)。間接ELISA還提供了更大的靈活性,，因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用,。間接ELISA實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會(huì)增加背景,，同時(shí)與直接ELISA相比，間接ELISA實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟,，實(shí)驗(yàn)周期延長,。
3. 夾心ELISA
先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中，然后加入樣品,，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體,，則可稱為直接夾心ELISA,；如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA,。
夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍,；同時(shí)夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合,，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測,，靈活性較高。夾心ELISA的缺點(diǎn)是對配對抗體要求很高,，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體,，則需要進(jìn)行配對抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的,。
4. 競爭ELISA法
預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體,。實(shí)驗(yàn)時(shí),，加入待檢抗原（或抗體）,，如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體,；如果待檢測物是抗體,，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體,，最后加底物顯色,。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。
競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些,，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式,。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高,，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。