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     Western Blot（WB）又名Western Bloting,、Western、蛋白質(zhì)印跡法,、免疫印跡試驗,，Western Blot 基本原理：首先利用SDS-PAGE對蛋白質(zhì)樣品進行分離，然后轉(zhuǎn)移到固相載體上,，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。轉(zhuǎn)移后的膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質(zhì)的進一步檢測,。印跡首先用蛋白溶液處理以封閉膜上剩余的疏水結(jié)合位點,，而后用所要研究的蛋白質(zhì)的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,，而其它的蛋白質(zhì)不能與一抗結(jié)合,，這樣清洗除去未結(jié)合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質(zhì)的位置上結(jié)合著一抗,。處理過的印跡進一步用適當(dāng)標(biāo)記的二抗處理,，二抗是指一抗的抗體，處理后,，帶有標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物可以指示一抗的位置,，即是待研究的蛋白質(zhì)的位置。

     WB實驗檢測結(jié)果背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不*,、顯色過度,、洗滌不充分,、轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純,。

1,、 封閉不*

一抗或二抗只要結(jié)合到膜上，就會顯色,。為了避免非特異性的結(jié)合,，應(yīng)用封閉液孵育膜，使所有的空白位點都被封閉蛋白占有,。NC膜推薦封閉液是3%的明膠,，室溫孵育1小時。如果想要低溫封閉的話,，可以用3%的BSA,。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。

傳統(tǒng)的牛奶/蛋白類封閉劑會形成較厚的,、粘粘的蛋白層,，導(dǎo)致與抗體發(fā)生非特異性相互作用，增加背景,；另一方面,，牛奶中本身含有的磷酸化蛋白會干擾蛋白磷酸化檢測。

2,、顯色過度

顯色時間的長短取決于蛋白條帶的數(shù)目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久,，背景就會偏高,。應(yīng)當(dāng)在蛋白條帶清晰可見，而背景幾乎沒有或很少時,，將膜及時取出,。

3、 洗滌不充分

在封閉以及抗體孵育之后,，至少要洗兩次膜,，每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高,，否則會把抗原從膜上洗下來,。

4、 轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備污染

使用清潔劑將轉(zhuǎn)印槽內(nèi)外*清洗干凈,，海綿墊也一定要認(rèn)真清洗,，臟的海綿墊通常是污染的最主要原因。另外,，每次轉(zhuǎn)膜時的緩沖液都要是新鮮配制的,。

5,、 抗體稀釋度不正確

一抗的稀釋度應(yīng)根據(jù)抗體來源和經(jīng)驗來決定。一般來說,，以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清,，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清?？贵w稀釋度不夠,，會產(chǎn)生非特異的結(jié)合，帶來高背景,。

6,、 二抗不純

沒有交叉吸附過的二抗可能會與膜上的其他蛋白相互作用，產(chǎn)生雜帶,。這種情況可以選用單克隆的二抗,。