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提取到質(zhì)量良好的RNA方法技術(shù)
閱讀:361 發(fā)布時間:2022-8-8 提取到質(zhì)量良好的RNA(包括總RNA和mRNA,,以下同),,概括起來有兩種方法,總結(jié)如下:
1,、檢測RNA溶液的吸光度
280,、320、230,、260nm下的吸光度分別代表了核酸,、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白等有機物的值,。一般的,,我們只看OD260/OD280(Ratio,R),。
1.82.0時,,我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的,不過要注意,,當(dāng)你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時,,R值可能會大于2(一般應(yīng)該是<2.2的)。當(dāng)R<1.8時,,溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯,你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當(dāng)R>2.2時,,說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了,。
如果RNA的量夠,,可在260nm(A260)用分光光度法測定RNA的得率,1個單位等于40ug/mlssRNA,。純RNA的A260/A280的比值為2.0,。A260/A230的比值還表明RNA的純度,其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留,,其值大于2.4,需用乙酸鹽,,乙醇沉淀RNA。
2,、RNA的電泳圖譜
一般的,,RNA的電泳都是用變性膠進行的,,但是根據(jù)我的經(jīng)驗,,如果你僅僅是為了檢測RNA的質(zhì)量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的,用普通的瓊脂糖膠就可以了。
電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值,,或者是mRNA smear的完整性。一般的,,如果28S和18S條帶明亮、清晰,、條帶銳利(指條帶的邊緣清晰),,并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,,我們認為RNA的質(zhì)量是好的。
以上是我們常用的兩種方法,,但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶,。如果溶液中有非常微量的RNA酶,,用以上方法我們很難察覺,,但是大部分后續(xù)的酶學(xué)反應(yīng)都是在37度以上并且是長時間進行的,。這樣,,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,,那么在后續(xù)的實驗中就會有非常適合的環(huán)境和時間發(fā)揮它們的作用了,,當(dāng)然這時你的實驗也就完了。