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標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展蕞早的一種是免疫熒光,，它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)，通過(guò)將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光步驟包括，細(xì)胞固定和通透,，封閉,，孵育一抗，二抗等,。除了這些基本步驟,，接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)方法希望可以幫到您。

1. 細(xì)胞固定和通透

為達(dá)到蕞佳的檢測(cè)效果,，細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)固定和通透,。步驟很重要，細(xì)胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu),，并利于抗體與抗原結(jié)合,。通常情況下，

2. 抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強(qiáng)的抗體,，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果,。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好,，但是正確的對(duì)照可以幫助精-準(zhǔn)定位抗原,。使用只有二抗染色的片子作為陰性對(duì)照，有利于減少降低背景干擾,。

3. 合適的抗體稀釋比例

通過(guò)優(yōu)化抗體稀釋比例來(lái)優(yōu)化染色,，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下,，可以通過(guò)增加濃度來(lái)提高信號(hào)強(qiáng)度。如果是第1次使用該抗體或測(cè)定某抗原,，強(qiáng)烈建議濃度梯度實(shí)驗(yàn),。

4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑

盡管很多抗原在常見(jiàn)的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對(duì)于某些目的抗原,，更換一下含有不同離子的緩沖液,，比如鈣、鎂,、鉀等,，可以帶來(lái)很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過(guò)的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實(shí)驗(yàn),。

5. 選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實(shí)驗(yàn),，我們強(qiáng)烈建議您選擇進(jìn)行過(guò)預(yù)吸附的二抗進(jìn)行單染實(shí)驗(yàn)；如果是雙重甚至是多重染色,，那么必須使用預(yù)吸附的二抗,。同時(shí)，請(qǐng)優(yōu)先選擇來(lái)自同一物種的二抗,。

6. 使用合適的細(xì)胞密度

選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行染色,，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過(guò)多時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好,，導(dǎo)致染色背景深,，低細(xì)胞密度，會(huì)使細(xì)胞貼壁不佳,，狀態(tài)不好,。

7. 多重染色

對(duì)同一樣本進(jìn)行兩個(gè)不同抗原的檢測(cè)時(shí)，可以用各自的抗體進(jìn)行同時(shí)染色,，但要求兩個(gè)一抗的種屬來(lái)源不同,，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來(lái)源需保持一致,。

8. 降低背景

高背景是免疫熒光常見(jiàn)的問(wèn)題,，解決此問(wèn)題可以用二抗來(lái)源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度,，增加洗滌次數(shù),，洗滌至少三次，每次五分鐘,，洗滌液為 PBS+0.05%Tween,。

9. 封片

作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率,，保護(hù)樣品,。

10. 數(shù)據(jù)分析

觀察整體樣片時(shí)，選擇具有代表性的細(xì)胞進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析,。

以上就是免疫熒光檢測(cè)的 10 種方法,，希望可以更好的服務(wù)于您的實(shí)驗(yàn)，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航,！