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標記免疫技術(shù)發(fā)展蕞早的一種是免疫熒光，它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),，通過將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光步驟包括,，細胞固定和通透，封閉,，孵育一抗,，二抗等。除了這些基本步驟,，接下來的實驗方法希望可以幫到您,。

1. 細胞固定和通透

為達到蕞佳的檢測效果，細胞需要經(jīng)過固定和通透,。步驟很重要,，細胞和抗原需要保證蕞佳的結(jié)構(gòu)，并利于抗體與抗原結(jié)合,。通常情況下,，

2. 抗體特異性

免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果,。在大多數(shù)情況下,，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精-準定位抗原,。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照,，有利于減少降低背景干擾。

3. 合適的抗體稀釋比例

通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色,，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達到特異性染色的結(jié)果,。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度,。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原,，強烈建議濃度梯度實驗,。

4. 優(yōu)化緩沖液和封閉劑

盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原,，更換一下含有不同離子的緩沖液,，比如鈣、鎂,、鉀等,，可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優(yōu)化過的 IHC 用封閉緩沖液,，同樣適用于熒光染色實驗,。

5. 選擇正確的二抗

如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預(yù)吸附的二抗進行單染實驗,；如果是雙重甚至是多重染色,，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時,，請優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗。

6. 使用合適的細胞密度

選擇合適的細胞數(shù)量進行染色,，當細胞數(shù)量過多時,，細胞結(jié)構(gòu)不好，導(dǎo)致染色背景深,，低細胞密度,，會使細胞貼壁不佳，狀態(tài)不好,。

7. 多重染色

對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時,，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同,，標記物不同,，而二抗的種屬來源需保持一致。

8. 降低背景

高背景是免疫熒光常見的問題,，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液,，降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù),，洗滌至少三次,，每次五分鐘，洗滌液為 PBS+0.05%Tween,。

9. 封片

作為免疫熒光的蕞后一步,，可以提高折射率，保護樣品,。

10. 數(shù)據(jù)分析

觀察整體樣片時,，選擇具有代表性的細胞進行數(shù)據(jù)獲取與分析,。

以上就是免疫熒光檢測的 10 種方法，希望可以更好的服務(wù)于您的實驗,，為您的實驗保駕護航,！