化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
質(zhì)粒提取鑒定及保存
閱讀：487 發(fā)布時間：2022-1-271、質(zhì)粒的提取 (Tiangen質(zhì)粒提取試劑盒)：
a) 挑菌： 選取培養(yǎng)板中大小中等的單個菌落,， 消毒牙簽接種到10ml搖菌管中,， 其中含有卡那-霉素的LB約5ml， 37 °C,， 220rpm恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過夜,。
b) 取上述2.0ml培養(yǎng)液， 于常溫下12000 rpm離心1分鐘,， 棄上清,， 干燥沉淀。
c) 加入250ul溶液P1(配有去RNA酶,， 4 °C保存),， 渦旋振蕩， *懸浮細(xì)菌,，不能留有沉淀,， 否則會影響裂解。
d) 加入250ul溶液P2,， 快速上下顛倒8次,， 常溫靜置3分鐘， 可見混合液逐漸變清,、 粘稠,， 表示已充分裂解。
e) 再加入350 ul溶液Ⅲ,， 快速上下顛倒8次,， 可見白色絮狀物出現(xiàn)。
f) 常溫12000rpm離心10分鐘,， 所得上清液倒入已經(jīng)用BL平衡過的過濾柱中,，注意不要倒入白色絮狀物沉淀， 靜置3分鐘,， 12000 rpm離心1分鐘,。
g) 加入500 ?l溶液PD， 12000 rpm離心1分鐘,。
h) 加入600 ?l溶液PW,， 12000 rpm離心1分鐘； 此步驟再重復(fù)1次,； 棄廢液后空管再次12000 rpm離心2分鐘,。
i) 于超凈臺通風(fēng)干燥， 放置2-5分鐘,， 加入33ul已加熱至65 °C的已滅菌的ddH 2 O,， 室溫靜置3分鐘， 12000 rpm離心2分鐘,， 得到相關(guān)質(zhì)粒DNA,， 測濃度， -20 °C保存?zhèn)溆谩?br/>
2,、質(zhì)粒鑒定及保存
取100ng上述提取的質(zhì)粒,， 進(jìn)行酶切(反應(yīng)體系見前)， 隨后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定(方法同前所述),， 最后將粗略鑒定正確的樣本送至生物技術(shù)公司測序,。 如測序正確， 用50%滅菌甘油300?l+700?l的菌液,， 標(biāo)記于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br/>
質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物純化(膠回收)
(1) 瓊脂糖電泳酶切或 PCR 相關(guān)產(chǎn)物。
(2) 在紫外投射反射儀割取含有目的片段的瓊脂糖凝膠片段,， 割取要迅速,， 以避免紫外線對 DNA 的損傷， 但注意盡量割取目的片段,， 減少無目的片段的凝膠量,， 以便提高純化回收效率。
(3) 用天平稱先稱區(qū)空 EP 管重量,， 再稱取含有凝膠的 EP 管重量,， 計算得到凝膠重量(mg)， 加入等量體積(?l) Bindingbuffer(如 1 mg=1 μl),。
(4) 將含有凝膠的 EP 管置入 60 °C 恒溫水浴箱中融化凝膠,， 持續(xù) 8-10min,，間或拿出搖勻， 以確保*凝膠溶解,。
(5) 將上述凝膠溶液轉(zhuǎn)移至干凈的純化柱上,， 室溫下靜置吸附 3 分鐘。
(6) 將純化柱 12000rpm 離心 1 分鐘,， 棄超濾液,， 必要時可將超濾液重新離心1 次可提供純化效率； 再次加入 100?l Binding buffer,， 12000rpm 離心 1 分鐘,。
(7)加入 700?l Wash buffer (事先已經(jīng)加入無水乙醇)， 12000 rpm 離心 1 分鐘,，棄超濾液,； 空管 12000 rpm 離心 2 分鐘。
(8) 純化柱置于 1.5 毫升干凈離心管中,， 于超凈臺通風(fēng)干燥 5 分鐘,。
(9) 加入 30?l 已加熱至 65 °C 的已滅菌的 ddH 2 O， 室溫靜置 3 分鐘,， 12000 rpm離心 2 分鐘,， 得到相應(yīng)的 DNA 片段， 測濃度,， -20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>