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質(zhì)粒提取鑒定及保存
閱讀：518 發(fā)布時(shí)間：2022-1-271,、質(zhì)粒的提取 (Tiangen質(zhì)粒提取試劑盒)：
a) 挑菌： 選取培養(yǎng)板中大小中等的單個(gè)菌落,， 消毒牙簽接種到10ml搖菌管中， 其中含有卡那-霉素的LB約5ml,， 37 °C,， 220rpm恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)過夜。
b) 取上述2.0ml培養(yǎng)液,， 于常溫下12000 rpm離心1分鐘,， 棄上清， 干燥沉淀,。
c) 加入250ul溶液P1(配有去RNA酶,， 4 °C保存),， 渦旋振蕩,， *懸浮細(xì)菌，不能留有沉淀,， 否則會(huì)影響裂解,。
d) 加入250ul溶液P2， 快速上下顛倒8次,， 常溫靜置3分鐘,， 可見混合液逐漸變清、 粘稠,， 表示已充分裂解,。
e) 再加入350 ul溶液Ⅲ， 快速上下顛倒8次,， 可見白色絮狀物出現(xiàn),。
f) 常溫12000rpm離心10分鐘， 所得上清液倒入已經(jīng)用BL平衡過的過濾柱中,，注意不要倒入白色絮狀物沉淀,， 靜置3分鐘， 12000 rpm離心1分鐘,。
g) 加入500 ?l溶液PD,， 12000 rpm離心1分鐘。
h) 加入600 ?l溶液PW,， 12000 rpm離心1分鐘,； 此步驟再重復(fù)1次； 棄廢液后空管再次12000 rpm離心2分鐘,。
i) 于超凈臺(tái)通風(fēng)干燥,， 放置2-5分鐘,， 加入33ul已加熱至65 °C的已滅菌的ddH 2 O， 室溫靜置3分鐘,， 12000 rpm離心2分鐘,， 得到相關(guān)質(zhì)粒DNA， 測(cè)濃度,， -20 °C保存?zhèn)溆谩?br/>
2,、質(zhì)粒鑒定及保存
取100ng上述提取的質(zhì)粒， 進(jìn)行酶切(反應(yīng)體系見前),， 隨后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳以鑒定(方法同前所述),， 最后將粗略鑒定正確的樣本送至生物技術(shù)公司測(cè)序。 如測(cè)序正確,， 用50%滅菌甘油300?l+700?l的菌液,， 標(biāo)記于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br/>
質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物純化(膠回收)
(1) 瓊脂糖電泳酶切或 PCR 相關(guān)產(chǎn)物,。
(2) 在紫外投射反射儀割取含有目的片段的瓊脂糖凝膠片段,， 割取要迅速， 以避免紫外線對(duì) DNA 的損傷,， 但注意盡量割取目的片段,， 減少無目的片段的凝膠量， 以便提高純化回收效率,。
(3) 用天平稱先稱區(qū)空 EP 管重量,， 再稱取含有凝膠的 EP 管重量， 計(jì)算得到凝膠重量(mg),， 加入等量體積(?l) Bindingbuffer(如 1 mg=1 μl),。
(4) 將含有凝膠的 EP 管置入 60 °C 恒溫水浴箱中融化凝膠， 持續(xù) 8-10min,，間或拿出搖勻,， 以確保*凝膠溶解。
(5) 將上述凝膠溶液轉(zhuǎn)移至干凈的純化柱上,， 室溫下靜置吸附 3 分鐘,。
(6) 將純化柱 12000rpm 離心 1 分鐘， 棄超濾液,， 必要時(shí)可將超濾液重新離心1 次可提供純化效率,； 再次加入 100?l Binding buffer， 12000rpm 離心 1 分鐘,。
(7)加入 700?l Wash buffer (事先已經(jīng)加入無水乙醇),， 12000 rpm 離心 1 分鐘，棄超濾液； 空管 12000 rpm 離心 2 分鐘,。
(8) 純化柱置于 1.5 毫升干凈離心管中,， 于超凈臺(tái)通風(fēng)干燥 5 分鐘。
(9) 加入 30?l 已加熱至 65 °C 的已滅菌的 ddH 2 O,， 室溫靜置 3 分鐘,， 12000 rpm離心 2 分鐘， 得到相應(yīng)的 DNA 片段,， 測(cè)濃度,， -20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>