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?聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實驗常見問題及解決方法
閱讀：3444 發(fā)布時間：2021-12-27PCR實驗原理：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴增反應(yīng),。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物,、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下,，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個引物分別位于靶序列兩端,，同兩條模板的3’端互補,，由此限定擴增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成,，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈,，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進行延伸,。理論上,，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴增到2n-1，考慮到擴增效率達不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴增到106倍,，足夠后續(xù)實驗展開,。PCR實驗常見問題及解決方法：
1. 無擴增條帶：
1) 酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活,，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果,。
2) 模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。
3) 變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符,，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活,；過低則模板變性不*。
4) 反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,，應(yīng)在未加Taq酶以前,，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。
5) 引物變質(zhì)失效,。人工合成的引物是否正確,。是否純化，或因儲存條件不當而失活,。
6) 引物錯誤,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
7) DNA凝膠電泳時加入陽性對照,，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題,。
2. PCR產(chǎn)物量過少：
1) 退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度,。
2) DNA模板量太少,。增加DNA模板量。
3) PCR循環(huán)數(shù)不足,。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù),。
4) 引物量不足,。增加體系中引物含量,。
5) 延伸時間太短,。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時間,。
6) 變性時間過長,。變性時間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活,。DNA模板中存在抑制劑,。確保DNA模板干凈,。
3. 擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
1) 酶量過高,。減少酶量,；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶,。
2) dNTP濃度過高,。減少dNTP的濃度,。
3) MgCl2濃度過高?？蛇m當降低其用量,。
4) 模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng,。
5) 引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng),。
6) 循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。
7) 退火溫度過低。
8) 電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；
②凝膠沒有凝固好,；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
9）若為PCR試劑盒則可能：
① 由于運輸儲存不當引起試劑盒失效,；
② 試劑盒本身質(zhì)量有問題,，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當,。
10）降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。
4. 擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)
1) 引物用量偏大，引物的特異性不高,。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量,。
2) 循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù),。
3) 酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。
4) 退火溫度偏低,，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度,，減少變性與延伸時間,，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度,。
5) 樣品處理不當,。
6) Mg2+濃度偏高，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度。
7) 若為PCR試劑盒,，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題,。
8) 復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生,。冰上準備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶,。
9) 反應(yīng)緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化*并*混勻,。
10) 引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。
11) 引物量過多,。減少反應(yīng)體系中引物的用量,。
12) 模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。
13) 外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。
5. 陰性對照出現(xiàn)條帶：
試劑，槍頭,，工作臺污染,。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔,。
6. 條帶大小與理論不符：
1) 污染,。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔,。
2) 模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板。
3) 基因亞型,。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究,。