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1.  預(yù)變性（Initial denaturation）

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘,。

2.  循環(huán)中的變性步驟

循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性,，可能的情況下可 縮短該步驟時間,，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*,，易造成擴(kuò)增失敗,。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度,。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估,。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響,。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）,。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略

延伸時間隨擴(kuò)增片段長短而定,，一般推薦在1000 bp以上,，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5.  循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增,。

6.  最后延伸

在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈,。