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?PCR的循環(huán)的參數(shù)
閱讀:637 發(fā)布時(shí)間:2021-12-161. 預(yù)變性(Initial denaturation)
模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要,,建議加熱時(shí)間參考試劑說明書,,一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃,,30秒足以使各種靶DNA序列*變性,,可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間,變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性,,過短靶序列變性不*,,易造成擴(kuò)增失敗。
3. 引物退火(Primer annealing)
退火溫度需要從多方面去決定,,一般根據(jù)引物的Tm值為參考,,根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估,。
退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響,。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行(Taq酶最適溫度)。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí),,本步驟可省略
延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定,,一般推薦在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp,。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),,過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
6. 最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后,,反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸*,,并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。