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技術(shù)文章

ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)未知抗原

閱讀:319          發(fā)布時(shí)間:2021-11-29

用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:

1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml,。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,,4℃過(guò)夜。次日,,棄去孔內(nèi)溶液,,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘,。(簡(jiǎn)稱洗滌,,下同)。

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,,置37℃孵育1小時(shí),。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔),。

3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml,。37℃孵育0.5~1小時(shí),,洗滌。

4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,,37℃10~30分鐘,。

5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,,依據(jù)所呈顏色的深淺,,以“+"、“-"號(hào)表示,。也可測(cè)O·D值:在ELISA檢測(cè)儀上,,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值,,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性,。方法二 用于檢測(cè)未知抗體的間接法:用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,,每孔加0.1ml,,4℃過(guò)夜。次日洗滌3次,。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌,。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中,,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最后一遍用DDW洗滌,。其余步驟同“雙抗體夾心法"的4,、5、6,。


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