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熒光定量PCR（qPCR）是目前病原檢測領(lǐng)域使用最為廣泛的核酸檢測方法（PCR檢測技術(shù)概述）,。尤其是非洲豬瘟發(fā)生后,，qPCR檢測得到了極大的普及，對于剛剛進入qPCR檢測領(lǐng)域的人,，很容易鉆入了“唯Ct值"的牛角尖,，今天我們就聊聊qPCR中的Ct值。

一,、Ct值的基本概念

1,、什么是Ct值

閾值循環(huán)數(shù) Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù),。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設(shè)為基線（baseline）,，是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍,。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié),。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值,。Ct會受到閾值的影響,，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導(dǎo)致基線不同，進而影響閾值和Ct值,。

模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系,起始模板量濃度越高,，Ct值越小,；起始模板量濃度越低,，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好,，即相同含量的初始模板,，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。

Ct值不是恒定不變的,，可以受到不同樣品,、不同儀器的影響,，即使相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2遍，Ct值也會存在差異,。

2,、與Ct值有關(guān)的參數(shù)

標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),，縱坐標代Ct值。

相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性,，通常要求>0.99,。

擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%,，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素,；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成,。

斜率Slope ：當(dāng)擴增效率為100%時斜率為-3.32,，當(dāng)90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。

3,、Ct值與模板拷貝數(shù)的關(guān)系

理想情況下,，qPCR的模板經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)進行指數(shù)擴增，擴增循環(huán)數(shù)和產(chǎn)物量之間的關(guān)系是：擴增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環(huán)數(shù)n,。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期,，擴增效率會逐漸降低,，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1,，初始濃度差2倍,。

由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,。這是目前的qPCR定量的方法,，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度,。分析定量時,，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量結(jié)果的不準確,。標準曲線需滿足：E：90%~110%,，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10,。同時定量標準品的量值需要準確可靠,。

用qPCR進行定量,，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結(jié)果,。