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生物素標(biāo)記反應(yīng)原理：

 NH2-Reactive Biotin專(zhuān)一的與伯胺反應(yīng)（N-末端及賴(lài)氨酸殘基側(cè)鏈）形成穩(wěn)定的酰胺鍵

 

一,、 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

仔細(xì)閱讀使用說(shuō)明書(shū),。

計(jì)算待使用NH2-Reactive Biotin的量,。

1.  提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的NH2- Reactive Biotin繼續(xù)放置冰箱中）,。

2.  溶解NH2-Reactive Biotin：加入30 μL DMF至NH2-Reactive Biotin瓶中,，靜置10 min，待其充分溶解,，此時(shí)生物素的濃度為10 mM,。

二、操作步驟：（本操作步驟按照1 mg的量進(jìn)行標(biāo)記）

1.  取1 mg待標(biāo)記抗體于Filtration tube中,，并加入相應(yīng)體積的 Labeling Buffer至總體積為0.5 mL，12,000 × g離心10 min,。（注：①Filtration tube的最大體積為0.5 mL,。②待標(biāo)記抗體濃度低時(shí)，可先超濾離心一次,。）

2.  加入13.3 μL NH2-Reactive Biotin 和適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,，使抗體的終濃度為2 mg/mL，并輕輕吹打混勻,。放入37℃恒溫箱中避光溫育30 min,。

3.  12,000× g離心10 min。

4.  加入適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中,，使終體積為0.5 mL,，并輕輕吹打混勻，12,000× g離心10 min,。并重復(fù)操作一次,。

5.  加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，輕輕吹打,。將濾芯倒轉(zhuǎn)放置于另一個(gè)離心管中,，6,000× g離心10 min。

6.  收集離心管中的溶液,，即為生物素標(biāo)記的抗體,。

三、注意事項(xiàng)：

1.  本試劑盒也可標(biāo)記其它含有氨基（NH2-）的抗原,、HRP,、多肽，具體標(biāo)記比例根據(jù)待標(biāo)記物中氨基的數(shù)量確定。

2.  DMF要密封干燥保存,，使用完立即用封口膜封緊,。

3.  操作步驟5中，可用Labeling Buffer作為回收標(biāo)記抗體的緩沖液,，也可使用其它任何緩沖液或保護(hù)劑,。

4.  本試劑盒未開(kāi)封前的有效期為一年，請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用,。

5.  本試劑盒提供的為10 kDa的Filtration tube,，標(biāo)記抗原或多肽請(qǐng)注意分子量的大小。

6.  在步驟2中,，標(biāo)記其它抗體時(shí),，我們應(yīng)先控制抗體的終濃度為2 mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計(jì)算應(yīng)加入NH2-Reactive Biotin的體積,。