化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
生化試劑類使用方法
閱讀：682 發(fā)布時(shí)間：2021-4-21生化試劑類作用：
1,、蛋白酶K：能水解消化蛋白質(zhì),，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，在尿素和SDS中穩(wěn)定,。一般工作濃度是50—100μg/ml,，推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl （pH7.5）,10mM CaCl2。
2,、SDS：十二烷基硫酸鈉,，溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,，并解離細(xì)胞中的核蛋白,，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀。
3,、IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,， 常用于藍(lán)白斑篩選及IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)的蛋白表達(dá)等。IPTG和乳糖的結(jié)構(gòu)相似,，所以它和乳糖一樣,，可以與乳糖操縱元的阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的空間構(gòu)像變化,，四聚體解聚成單體,，失去與操縱子特異性結(jié)合的能力，從而解除了阻遏蛋白的作用,，使其后的基因得以轉(zhuǎn)錄合成利用乳糖的酶類,。與乳糖不同的是，IPTG不被 β-半乳糖苷酶水解,。常與X-GAL一起用于藍(lán)白斑篩選,。作用*的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,。
4,、X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,，是IPTG的顯色試劑，在IPTG的催化下顯藍(lán)色,。常跟IPTG一起用與藍(lán)白斑篩選,。
5、G418：一種抗生素,，對(duì)幾乎所有的細(xì)胞都有毒性,，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后,，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng),。Ｇ418的這一選擇特性 ,，已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除,、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用,。
6、DMSO：二甲基亞砜,。實(shí)驗(yàn)室常用于作液體層析溶劑,，同時(shí)用作測(cè)試物質(zhì)紫外消光值上時(shí)用作參照物。能溶于所有烷烴和烯烴,。
7,、曲拉通X-100：TritonX-100，用的細(xì)胞裂解液成分之一,，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用,， 能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40,。
8,、NP-40：很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,，而對(duì)核膜破壞的作用弱,，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白,。
9,、BSA：牛血清白蛋白， 主要起維持滲透壓作用,、PH緩沖作用,、載體作用和營(yíng)養(yǎng)作用。在動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)中,，添加白蛋白可起到生理和機(jī)械保護(hù)作用和載體作用,。常用于蛋白定量中的內(nèi)參和抗體稀釋液,。
10、甲酰胺： 甲酰胺被用作凝膠電泳中RNA的穩(wěn)定劑,，也用于穩(wěn)定毛細(xì)管電泳中的變性單股DNA,。
生化試劑類使用方法：
注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻,，6,000rpm離心數(shù)秒后使用,。
1.樣本處理（樣本處理區(qū)）
待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀等，具體提取方法請(qǐng)參照相關(guān)說(shuō)明書,；陽(yáng)性質(zhì)控品及陰性質(zhì)控品無(wú)需提取,，可直接使用。
2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）
取N個(gè)（N=陰性質(zhì)控品+待檢樣本+陽(yáng)性質(zhì)控品）PCR反應(yīng)管,，每管分別加入FMD RT-PCR反應(yīng)液19μl,、RT-PCR酶1 μl (也可根據(jù)每頭份用量計(jì)算N+1份FMD RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶所需總量,，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個(gè)PCR反應(yīng)管),。
組分每頭份用量FMD RT-PCR反應(yīng)液19 μlRT-PCR酶。
1 .將所有PCR反應(yīng)管于6,000rpm離心30s,，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。
2.加樣（樣本處理區(qū)）
3.在上述的PCR反應(yīng)管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品各5 μl,，蓋緊管蓋,，于6,000rpm離心10s，轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增區(qū),。