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[操作步驟] 1,、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔,、空白孔,。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)備2),?？瞻卓准?00μL(見試劑準(zhǔn)備第二步后一管)，余孔加待測(cè)樣品100μL,，酶標(biāo)板加上覆膜,，37oC溫育2小時(shí)。

2,、 棄去液體,，甩干，不用洗滌。

3,、 每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μL(臨用前配制),，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC溫育1小時(shí),。

4,、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌,，浸泡1-2分鐘,，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),，重復(fù)洗板3次。后一次洗滌后,，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干,。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。

5,、 每孔加檢測(cè)溶液B工作液(臨用前配制)100μL,，加上覆膜，37oC溫育30分鐘,。

6,、 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，方法同步驟4。

7,、 每孔加底物溶液90μL,，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-25分鐘,，不要超過30分鐘,。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí),，即可終止),。

8、 每孔加終止溶液50μL,，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同,。如出現(xiàn)顏色不勻一,，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻,。

9、 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后,，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(O.D.值)。