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[操作步驟] 1,、 加樣：分別設標準孔,、待測樣品孔、空白孔,。設標準孔7孔,，依次加入100μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)?？瞻卓准?00μL(見試劑準備第二步后一管),，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜,，37oC溫育2小時,。

2、 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。

3,、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制),，酶標板加上覆膜,，37oC溫育1小時。

4,、 棄去孔內液體,，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘,，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干),，重復洗板3次,。后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液*甩干,。自動洗板機亦可,。

5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL,，加上覆膜,，37oC溫育30分鐘。

6,、 棄去孔內液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟4,。

7、 每孔加底物溶液90μL,，酶標板加上覆膜,，37oC避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘,。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止),。

8,、 每孔加終止溶液50μL，終止反應,，此時藍色立轉黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一,，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻,。

9、 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后,，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值),。