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         液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上,，引用了氣相色譜的理論,，在技術(shù)上,，流動(dòng)相改為高壓輸送（zui高輸送壓力可達(dá)4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器,，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè),。 特點(diǎn) 1．高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱,，受到阻力較大,，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓,。一般可達(dá)150～350×105Pa,。 2. 高速：流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1～10ml/min,。液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多,，一般少于 1h 。 3. ：近來研究出許多新型固定相,，使分離效率大大提高,。 4.高靈敏度：液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器,，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g,。另外,，用樣量小，一般幾個(gè)微升,。 5.適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好,，靈敏度高，分析速度快,，操作方便等優(yōu)點(diǎn),，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析,。而液相色譜法,，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣?，因此不受試樣揮發(fā)性的限制,。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差,、相對(duì)分子量大（大于 400 以上）的有機(jī)物（這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的 75% ～ 80% ）原則上都可應(yīng)用液相色譜法來進(jìn)行分離,、分析。 據(jù)統(tǒng)計(jì),，在已知化合物中,，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%,。 液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為凝膠色譜,、疏水性液相色譜、反相液相色譜,、離子交換液相色譜,、親和液相色譜以及聚焦液相色譜等類型。用不同類型的液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似,。其不同之處是液相色譜靈敏,、快速、分辨率高,、重復(fù)性好,，且須在色譜儀中進(jìn)行。 液相色譜法的主要類型及其分離原理 根據(jù)分離機(jī)制的不同,，液相色譜法可分為下述幾種主要類型： 1 ．液 — 液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動(dòng)相和固定相都是液體,。流動(dòng)相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個(gè)明顯的分界面,。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱,，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時(shí),，服從于下式： 式中,，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm--溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度,； Vs—固定相的體積,；Vm—流動(dòng)相的體積。LLPC與GPC有相似之處,，即分離的順序取決于K,，K大的組分保留值大；但也有不同之處,，GPC中,，流動(dòng)相對(duì)K影響不大，LLPC流動(dòng)相對(duì)K影響較大,。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性小于固定液的極性,。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動(dòng)相的極性大于固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動(dòng)相與固定相的極性要求*不同,，但固定液在流動(dòng)相中仍有微量溶解,；流動(dòng)相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會(huì)造成固定液流失,。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后）,，可克服上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70~80%）,。 2 ．液 — 固色譜法 流動(dòng)相為液體,，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）,。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的,。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí),，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附（未進(jìn)樣時(shí),，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中：Xm--流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子,；Sa--固定相中的溶劑分子,；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動(dòng)相中的溶劑分子,。 當(dāng)吸附競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)平衡時(shí)： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數(shù),。[討論：K越大，保留值越大,。] 3 ．離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相,。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換,，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。 以陰離子交換劑為例,，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) + (樹脂-R4N+Cl-)=== (樹脂-R4N+ X-) + Cl- (溶劑中) 當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)： KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系數(shù)為： DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關(guān)系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離,。 4 ．離子對(duì)色譜法(Ion Pair Chromatography) 離子對(duì)色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對(duì)離子或反離子 ) 加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物,，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為,。其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機(jī)相 式中：X+水相--流動(dòng)相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動(dòng)相中帶相反電荷的離子對(duì)（如氫氧化四丁基銨,、氫氧化十六烷基*銨等）,；X+Y---形成的離子對(duì)化合物。 當(dāng)達(dá)平衡時(shí)： KXY = [X+Y-]有機(jī)相/[ X+]水相[Y-]水相 根據(jù)定義,，分配系數(shù)為： DX= [X+Y-]有機(jī)相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關(guān)系] 離子對(duì)色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題,，諸如酸、堿和離子,、非離子混合物,，特別是一些生化試樣如核酸、核苷,、生物堿以及藥物等分離,。 5 ．離子色譜法(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動(dòng)相,。以電導(dǎo)檢測(cè)器為通用檢測(cè)器,，為消除流動(dòng)相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對(duì)電導(dǎo)檢測(cè)器的干擾，設(shè)置了抑制柱,。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同,。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例,。當(dāng)待測(cè)陰離子Br-隨流動(dòng)相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時(shí),，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程）： 抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)： R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水,，消除了本底電導(dǎo)的影響,；試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H+Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測(cè),。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的*方法,。也可用于陽離子分析。 6 ．空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相,。它類似于分子篩的作用,，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離,，而是按分子大小進(jìn)行分離,。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動(dòng)力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后,，隨流動(dòng)相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過,。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子,，首先在色譜圖上出現(xiàn),，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值z(mì)ui大,，在色譜圖上zui后出現(xiàn),。 液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng),、．分離系統(tǒng),、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn),。 1．進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的,。 2．輸液系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括高壓泵,、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l．47～4．4X107Pa,，流速可調(diào)且穩(wěn)定,，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),，可加快其在柱中的移動(dòng)速度,，這對(duì)提高分辨率、回收樣品,、保持樣品的生物活性等都是有利的,。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,，包括改變洗脫液的極性,、離子強(qiáng)度、PH值,，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等,。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離,。 3.分離系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括色譜柱,、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管）,，內(nèi)徑為2～5mm,，由"不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）．固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）,、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣）,，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基,、季胺基、羥甲基,、苯基,、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此,，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性,。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后,，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來,。 另外，固定相基質(zhì)粒小,，柱床極易達(dá)到均勻,、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng),?；|(zhì)粒度小，微孔淺,，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短,。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的,。根據(jù)柱效理論分析,，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大,。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小,，會(huì)提高分辨率的道理。 再者,，液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間,，就可增加層析柱的效率,。 4．檢測(cè)系統(tǒng) 液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器,、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。 （1）紫外檢測(cè)器 該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測(cè),。其特點(diǎn)：使用面廣（如蛋白質(zhì),、核酸、氨基酸,、核苷酸,、多肽、激素等均可使用）,；靈敏度高（檢測(cè)下限為10-10g／ml）,；線性范圍寬；對(duì)溫度和流速變化不敏感,；可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品,。 （2）示差折光檢測(cè)器 凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè),。目前,，糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng),、操作簡(jiǎn)單,，但靈敏度低（檢測(cè)下限為10-7g／ml），流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化,，因此,，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測(cè),。 （3）熒光檢測(cè)器 凡具有熒光的物質(zhì),，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比,。因此,，這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸,、胺類,、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測(cè)定，其靈敏度很高（檢測(cè)下限為10-12～10-14g／ml）,，痕量分析和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可采用,。 （5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存,、顯示,、打印和處理等操作，使樣品的分離,、制備或鑒定工作能正確開展,。