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                                      藥敏實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：

1.1培養(yǎng)基：如做大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)可選擇普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或麥康凱培養(yǎng)基,，做沙門氏菌可選擇SS培養(yǎng)基，巴氏桿菌可選擇血液瓊脂,。

1.2藥敏試紙：購(gòu)買,、自制或廠家提供

1.3細(xì)菌：從病雞病變部位提取，如肝臟,、心臟,、脾臟等臟器。

1.4接種環(huán),、酒精燈,、打孔器、牛津杯

1.5移液器,、滴頭

2.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

2.1藥敏片的準(zhǔn)備：自制

2.1.1藥敏片的制備：取定性濾紙,，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片,，取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中,，瓶口以單層牛皮紙包扎，經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后,，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天,，使*干燥。

2.2.2抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jī)?nèi)加入藥液適量,，并翻動(dòng)紙片,，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛,。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱,，放37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜，干燥后即密封,，切勿受潮,，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個(gè)月,。

2.2藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按商品藥治療量3-5倍比例配制藥液,；如治療量為1L水加1g藥，配制藥液時(shí)就是1g加200-300ml水或1L水加3-5g藥,，及配制藥敏片所用的藥液,。

3.實(shí)驗(yàn)操作方法：

3.1藥敏片法

3.1.1在“超凈臺(tái)”（或自制無(wú)菌操作臺(tái)）中，用（酒精燈）經(jīng)火焰滅菌的接種環(huán)從病料中挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物,，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上,。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌,，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2，然后找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2,，依次劃線,，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可將待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液,，將少量混懸液倒入平皿培養(yǎng)基上,，輕晃平皿使鋪勻，放置5-10min）,。

3.1.2將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停,，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼,，可用鑷子輕按幾下藥敏片,。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上,，一般可在平皿中央貼一片,，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼4-5片），每種藥敏片的名稱要記住,。

3.1.3將平皿培養(yǎng)基倒置放于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后,，觀察效果。

4.結(jié)果觀察：

在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上,，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散,，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,。過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈,，抑菌圈越大，說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大,，反之越小,，若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性,。其直徑大小與藥物濃度,、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

5.判定標(biāo)準(zhǔn)：

5.1藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn),。

  表1  藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

5.2 藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，抑菌圈直徑在15毫米以上為高敏,，10毫米以下為低敏,，無(wú)抑菌圈為不敏。

6.影響藥敏結(jié)果的因素：

6.1培養(yǎng)基：應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌的營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制,。傾注平板時(shí),，厚度合適（約5-6mm）,，不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿,，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜,。培養(yǎng)基內(nèi)應(yīng)盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣,、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性,，胸腺嘧啶核苷和對(duì)氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

6.2細(xì)菌接種量：細(xì)菌接種量應(yīng)恒定,，如太多,，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性,。

6.3藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗(yàn)的結(jié)果,，需配制。

6.4培養(yǎng)時(shí)間：一般培養(yǎng)溫度和時(shí)間為37℃,、12-24小時(shí),，有些抗菌藥擴(kuò)散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基,，先置4℃冰箱內(nèi)2-4小時(shí),，使抗菌藥預(yù)擴(kuò)散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng),，可以推遲細(xì)菌的生長(zhǎng),，而得到較大的抑菌圈。

7.應(yīng)用

藥敏實(shí)驗(yàn)后,，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用,，以減少耐藥菌株,。選擇高敏藥物時(shí)應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，因?yàn)槲覀兯幟魧?shí)驗(yàn)是藥液直接和細(xì)菌接觸,，而在給禽用藥的時(shí)候,，必須通過(guò)機(jī)體的吸收才能使藥物達(dá)到一定的效果，所以在給禽用藥時(shí),，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法,，這樣才會(huì)達(dá)到好的治療效果。

附表2  山東省2004年1-5月份大腸桿菌和沙門氏菌常用藥物敏感程度參考表