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甲醛洋菜膠體電泳

2012-7-14  閱讀(1371)

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甲醛洋菜膠體電泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)甲醛是一種常用的RNA 變性劑,。在進(jìn)行甲醛洋菜膠體電泳分析時,必須先配制含有甲醛的洋菜膠體,,RNA 也必須先以甲醛及formamide 進(jìn)行變性處理,,以確保其二度結(jié)構(gòu)充分被打開。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì),,配制膠體及進(jìn)行電泳分析時都應(yīng)在抽氣櫥里小心操作,;進(jìn)行電泳時所使用的緩沖液為MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)。此外,,含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜,,容易破裂,在移動膠體時應(yīng)特別留神,。由于rRNA 占細(xì)胞RNA總量的80~85%,,以ethidium bromide 染色后,呈現(xiàn)于膠體上的兩個主要RNA色帶應(yīng)該分別是large 與small rRNAs (真核生物為28S 與18S,,原核生物為23S 與16S),;散布于small rRNA 附近,呈淡淡smear 的就是mRNAs,,這是因?yàn)閙RNAs 存在量不多,,而且長度不一的緣故。長度較短的5S rRNA 及tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現(xiàn),。

 
    儀器用具:65℃恒溫水槽,;微量離心機(jī);Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器,;UV transilluminator,;防護(hù)面罩;拍立得相機(jī),;抽氣櫥
 
 
    藥品試劑:
    自菌體抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 與胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所制備的正意股及反意股RNA (#1, #2, #3, and #4),。
    5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)
    Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA)
    Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)
    dH2O/DEPC
 
    方法步驟:
    ◆ 注意:
    a. 下列實(shí)驗(yàn)主要參照Sambrook and Russell (2001) 的方法。
    b. 進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)時請務(wù)必戴手套,。
    c. 甲醛與formamide 都放在抽氣櫥內(nèi),。
    準(zhǔn)備一片1.2%甲醛洋菜膠體:
    1) 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶,,加入25 mL dH2O/DEPC。
    2) 以微波爐加熱溶解的后,,微微晃動血清瓶使混合均勻,,再移至60℃恒溫水槽靜置5 min。
    3) 將裝著agarose 溶液的血清瓶移至抽氣櫥,,加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛,輕輕搖晃血清瓶以便混合均勻,。
??  膠體總體積為40 mL,,為了避免agarose 溶液因溫度快速下降,很快便凝固,,應(yīng)力求動作迅速,,但應(yīng)避免劇烈搖晃,以免弄出一大堆氣泡,,影響膠體凝結(jié),。
    4) 盡速于抽氣櫥內(nèi)把混合液倒入膠體鑄模,并插入樣本梳 (teeth comb),。膠體凝固至少需時30 min,。
    電泳:
    1) 要進(jìn)行電泳時,把已凝固的洋菜膠體放進(jìn)電泳槽,,并加入適量1×formadehyde gel running buffer,。
    2) 以50 V 定電壓預(yù)跑5 min。
    3) 依序注入上列8 個RNA 樣本,,以50 V 定電壓進(jìn)行電泳,,待追蹤染劑移動至膠體三分的二處時,關(guān)閉電源,,將膠體移至UV transilluminator box,,觀察RNA 色帶的存在情形,并拍照存證,。
??  注意:這一片膠體往下將用來進(jìn)行北方轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn),,請小心處置!

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