甲醛洋菜膠體電泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)甲醛是一種常用的RNA 變性劑,。在進(jìn)行甲醛洋菜膠體電泳分析時(shí),,必須先配制含有甲醛的洋菜膠體,RNA 也必須先以甲醛及formamide 進(jìn)行變性處理,,以確保其二度結(jié)構(gòu)充分被打開(kāi),。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì),配制膠體及進(jìn)行電泳分析時(shí)都應(yīng)在抽氣櫥里小心操作,;進(jìn)行電泳時(shí)所使用的緩沖液為MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid),。此外,含有甲醛的洋菜膠體比較滑溜,,容易破裂,,在移動(dòng)膠體時(shí)應(yīng)特別留神。由于rRNA 占細(xì)胞RNA總量的80~85%,,以ethidium bromide 染色后,,呈現(xiàn)于膠體上的兩個(gè)主要RNA色帶應(yīng)該分別是large 與small rRNAs (真核生物為28S 與18S,,原核生物為23S 與16S),;散布于small rRNA 附近,呈淡淡smear 的就是mRNAs,,這是因?yàn)閙RNAs 存在量不多,,而且長(zhǎng)度不一的緣故。長(zhǎng)度較短的5S rRNA 及tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現(xiàn),。
儀器用具:65℃恒溫水槽,;微量離心機(jī);Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器,;UV transilluminator,;防護(hù)面罩;拍立得相機(jī),;抽氣櫥
藥品試劑:
自菌體抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 與胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所制備的正意股及反意股RNA (#1, #2, #3, and #4),。
5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)
Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA)
Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)
dH2O/DEPC
方法步驟:
◆ 注意:
a. 下列實(shí)驗(yàn)主要參照Sambrook and Russell (2001) 的方法。
b. 進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)務(wù)必戴手套,。
c. 甲醛與formamide 都放在抽氣櫥內(nèi),。
準(zhǔn)備一片1.2%甲醛洋菜膠體:
1) 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶,加入25 mL dH2O/DEPC,。
2) 以微波爐加熱溶解的后,,微微晃動(dòng)血清瓶使混合均勻,再移至60℃恒溫水槽靜置5 min,。
3) 將裝著agarose 溶液的血清瓶移至抽氣櫥,,加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛,輕輕搖晃血清瓶以便混合均勻,。
?? 膠體總體積為40 mL,,為了避免agarose 溶液因溫度快速下降,,很快便凝固,應(yīng)力求動(dòng)作迅速,,但應(yīng)避免劇烈搖晃,,以免弄出一大堆氣泡,影響膠體凝結(jié),。
4) 盡速于抽氣櫥內(nèi)把混合液倒入膠體鑄模,,并插入樣本梳 (teeth comb)。膠體凝固至少需時(shí)30 min,。
電泳:
1) 要進(jìn)行電泳時(shí),,把已凝固的洋菜膠體放進(jìn)電泳槽,并加入適量1×formadehyde gel running buffer,。
2) 以50 V 定電壓預(yù)跑5 min,。
3) 依序注入上列8 個(gè)RNA 樣本,以50 V 定電壓進(jìn)行電泳,,待追蹤染劑移動(dòng)至膠體三分的二處時(shí),,關(guān)閉電源,將膠體移至UV transilluminator box,,觀察RNA 色帶的存在情形,,并拍照存證。
?? 注意:這一片膠體往下將用來(lái)進(jìn)行北方轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn),,請(qǐng)小心處置,!