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退火溫度是PCR反應(yīng)中的重要影響因素
閱讀：21249 發(fā)布時間：2021-8-3
PCR（Polymerase Chain Reaction,，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的的技術(shù),，通過多個循環(huán)的變性,、退火和延伸,，能夠使微量的遺傳物質(zhì)在幾小時內(nèi)得到幾百萬倍的擴(kuò)增,。其基本過程為變性,、退火和延伸,，這三步需要不同的溫度條件,。
那么，怎樣確定退火溫度,？
退火溫度主要取決于引物的堿基組成,、長度和濃度。而合適的退火溫度對PCR反應(yīng)的特異性尤為關(guān)鍵,。一般來說,，退火溫度的高低影響同時影響PCR反應(yīng)的特異性和靈敏性（擴(kuò)增效率），且兩者呈負(fù)相關(guān),，即較低的退火溫度可提高PCR反應(yīng)的靈敏性但其特異性較差,，而較高的退火溫度則可以提高反應(yīng)的特異性但卻降低了其擴(kuò)增效率。
通常,，在Tm值允許范圍內(nèi)選擇偏高的退火溫度以提高PCR反應(yīng)的特異性,。當(dāng)然，實(shí)際的退火溫度還是要以對應(yīng)的PCR反應(yīng)的要求做出調(diào)整,。
事實(shí)上,，根據(jù)退火溫度的文字性定義可以看出,，退火溫度的設(shè)定與引物的Tm值(熔解溫度)有一定的關(guān)系。因此大多數(shù)童鞋在設(shè)定退火溫度時,，會以兩條引物中較低的Tm值再減去5℃,。
而對于Tm值的確定，又是一個問題,。商品化的引物會有一個建議的Tm值,，而自己合成的Tm值需要進(jìn)行計算，可以通過引物設(shè)計軟件（primer premier 5.0,，Oligo 6.22等）或在線的引物設(shè)計網(wǎng)站進(jìn)行Tm值的確定,。但由于計算方法的不同，同樣一段引物在不同引物設(shè)計軟件或網(wǎng)站得到的Tm值有所差別,。
種種以上,，我們不難看出一個合適的退火溫度并不好確定。因此,，優(yōu)化退火溫度理想的方法是設(shè)置一系列的對照反應(yīng),，即通過在低于計算出的引物Tm值2~10℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行退火的一系列平行反應(yīng)來確定退火溫度。
溫度梯度PCR儀是在普通PCR儀基礎(chǔ)上帶有設(shè)置溫度梯度功能的PCR儀,，梯度PCR儀除具有普通PCR儀的結(jié)構(gòu)外,，還具有特殊的梯度模塊，可實(shí)現(xiàn)對梯度溫度和梯度時間等參數(shù)的調(diào)整,。因此可以在一次實(shí)驗中對不同樣品設(shè)置不同的退火溫度和退火時間,，從而可在短時間內(nèi)對PCR實(shí)驗條件進(jìn)行優(yōu)化，提高PCR科研效率,。