垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

學(xué)習(xí) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS—PAGE)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本

操作技術(shù),。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的 pH 條件下解離而帶電荷,。當(dāng)溶液的 pH 大于蛋白

質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)時(shí),，蛋白質(zhì)本身帶負(fù)電，在電場(chǎng)中將向正極移動(dòng),；當(dāng)溶液的 pH 小于蛋

白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí),，蛋白質(zhì)帶正電，在電場(chǎng)中將向負(fù)極移動(dòng),；蛋白質(zhì)在特定電場(chǎng)中移動(dòng)

的速度取決于其本身所帶的凈電荷的多少,、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場(chǎng)強(qiáng)度

等,。

聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié)

構(gòu),。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的

兩層凝膠,；這樣,，當(dāng)含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時(shí)，受阻滯的程

度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率,。由于上層膠的孔徑較大,，不同大小的蛋白質(zhì)分子在

通過大孔膠時(shí)，受到的阻滯基本相同,，因此以相同的速率移動(dòng),；當(dāng)進(jìn)入小孔膠時(shí)，

分子量大的蛋白質(zhì)移動(dòng)速度減慢,，因而在兩層凝膠的界面處,，樣品被壓縮成很窄的

區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng),。同時(shí),，在制備上層膠(濃縮膠)和下層

膠(分離膠)時(shí)，采用兩種緩沖體系,；上層膠 pH=6.7—6.8,，下層膠 pH＝8.9；Tris —HCI 緩沖液中的 Tris 用于維持溶液的電中性及 pH,，是緩沖配對(duì)離子；CI-是前導(dǎo)

離子,。在 pH6.8 時(shí),，緩沖液中的 Gly-為尾隨離子，而在 pH＝8.9 時(shí),，Gly 的解離度

增加,；這樣濃縮膠和分離膠之間 pH 的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度,，進(jìn)而達(dá)到

控制其有效遷移率之目的,。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，在進(jìn)入分離膠后,，各種

蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同,，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳中

存在的濃縮效應(yīng),，分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng),，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場(chǎng)中達(dá)到有效

的分離。

如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS),，由于 SDS 帶

有大量的負(fù)電荷,，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強(qiáng)還原劑如

巰基乙醇存在下,，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原,，肽鏈*伸展,，使蛋白質(zhì)分子與

SDS 充分結(jié)合，形成帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)—SDS 復(fù)合物,；此時(shí),，蛋白質(zhì)分子上所帶的負(fù)

電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異,。

蛋白質(zhì)分子量愈小,，在電場(chǎng)中移動(dòng)得愈快；反之,，愈慢,。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷

移率之間的關(guān)系是：

Mr=K(10-b· m) logMr=LogK—b·Rm，

式中 Mr ——蛋白質(zhì)的分子量,；

logK——截距,；

b——斜率；

Rm ——相對(duì)遷移率,。

實(shí)驗(yàn)證明,，蛋白質(zhì)分子量在 15,000—200,000 的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量

的對(duì)數(shù)之間呈線性關(guān)系,。蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率 Rm＝蛋白質(zhì)樣品的遷移距離／染料(溴

酚藍(lán))遷移距離,。這樣，在同一電場(chǎng)中進(jìn)行電泳,，把標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率與相應(yīng)

的蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)作圖,，由未知蛋白的相對(duì)遷移率可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出它的分子

量。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量具有簡(jiǎn)便,、快速,、重

復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是目前一般實(shí)驗(yàn)室常用的測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法,。

三,、試劑及主要器材

1．主要試劑

1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合液

內(nèi)含：兔磷酸化酶 B(Mw 97,400)，牛血清蛋白(Mw 66,200),，兔肌動(dòng)蛋白(Mw 43,000),，

牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和雞蛋清溶菌酶(Mw 14,400)

2)30％凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis） 0.8g,

加雙蒸水至 100mL,。外包錫紙,，4℃冰箱保存，30 天內(nèi)使用,。

3)分離膠緩沖液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加雙蒸水溶解,6mol/L HCl 調(diào) pH8.8,

定容 100mL,。4℃冰箱保存

4)濃縮膠緩沖液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl 調(diào) pH6.8，并

定容到 100mL,。4℃冰箱保存

5)電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg,，Tris 3g，Gly 14.4g,，加雙蒸水溶解并定容到 1000mL,。

4℃冰箱保存。

6)10％SDS,，室溫保存

7)質(zhì)量濃度 10％過硫酸銨(新鮮配制)

8)上樣緩沖液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL,，甘油 2mL，10％SDS 2mL,，

β-巰基乙醇 1mL,，0.1％溴酚藍(lán) 0.5mL，加蒸餾水定溶至 10mL,。

9)0.25％考馬斯亮藍(lán) R-250 染色液：0.25g 考馬斯亮藍(lán) R250,，加入 91ml50%甲醇，

9ml 冰醋酸

10)脫色液：50ml 甲醇,，75ml 冰醋酸與 875ml 雙蒸水混合

11)未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mg／mL )

2．實(shí)驗(yàn)器材

1) DYCZ-24D 垂直板電泳槽(北京市六一儀器廠)

2) 電泳儀

3) 長(zhǎng)滴管及微量加樣器

4) 燒杯(250mL,、500m1)、量筒(500mL,、 250m1),、培養(yǎng)皿(15cm´l5cm)

5) 注射器等

四、實(shí)驗(yàn)操作

1． 裝板

將密封用硅膠框放在平玻璃上,，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊,，將兩塊玻璃立

起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi),，然后插入斜插板到適中

程度, 即可灌膠。

2． 凝膠的聚合

分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例,，配置 10％的分離膠和 4.8％的濃

縮膠,。

試劑名稱 10%的分離膠 5%的濃縮膠

Acr/Bis 30%/ml

分離膠緩沖液（pH8.9）/ml

濃縮膠緩沖液（pH6.8）

10%SDS/ml

10%過硫酸銨/ul

雙蒸水/ml

TEMED/ul

按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長(zhǎng)玻璃板的內(nèi)面緩

緩用滴管滴入,，小心不要產(chǎn)生氣泡,。將膠液加到距短玻璃板上沿 2cm 處為止,約 5mL。

然后用細(xì)滴管或注射器仔細(xì)注入少量水,約 0.5-1mL,。室溫放置聚合 30-40min,。

待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分,，按上表制備濃縮膠,。用

長(zhǎng)滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子(梳子)；待濃縮膠聚合后,，小心拔出樣

品模子,。

3．蛋白質(zhì)樣品的處理

若標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取 lmg 的樣品溶解于 lmL 0.5mol

／L pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸餾水中,；若樣品是液體,，要測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按 1.0～

1.5mg／mL溶液比例,，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻,。本實(shí)驗(yàn)所用樣品為 15～

20mg 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品溶液，放置在 0.5mL 的離心管中,，加入 15—20ml 的樣品處理液,。

在 100℃水浴中處理 2min，冷卻至室溫后備用,。

吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品 20ml,，按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白的處理方法進(jìn)行處理。

4． 加樣

SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法

用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠

框,注意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個(gè)夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電

泳槽,插入斜板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上,外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿

3mm 處即可,注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡,。

加樣時(shí)可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi),，以準(zhǔn)確定位加樣位置，或用微量

注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣,，各加 10～15ml(含蛋白質(zhì) 10～15mg),，稀溶液可加

20～30ml (還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握)。

5．電泳

加樣完畢,，蓋好上蓋,，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后,，樣品進(jìn)膠前電流控制

在 15～20mA,，大約 15～20min；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后,，電流升到

30～45mA,，電泳過程保持電流穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿 1～2cm 處即停止

電泳,，約 1-2 小時(shí),。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水,，降低電泳溫度,。

6．染色、脫色

電泳結(jié)束后,，關(guān)掉電源,，取出玻璃板,，在長(zhǎng)短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕

輕撬動(dòng),，即將膠面與一塊玻璃板分開,，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入

銅絲作為標(biāo)志,，放入大培養(yǎng)皿中染色,，使用 0.25％的考馬斯亮藍(lán)染液，染色 2～4h,，

必要時(shí)可,。

棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次,，然后加入脫色液,，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng)

常換脫色液,，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止,。

7．結(jié)果處理

1)測(cè)量脫色后凝膠板的長(zhǎng)度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔

的距離)，測(cè)量指示染料遷移的距離,。

2)按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率(Rm)

相對(duì)遷移率＝樣品遷移距離(cm)／染料遷移距離(cm)

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo),，蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)為

縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

4)測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查

得該蛋白質(zhì)的分子量。

4． 加樣

SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法