猴外周血單核細胞分離液試劑盒

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：2×100ml/Kit

猴外周血單核細胞試劑盒內(nèi)容：

全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 A 100ml

試劑 D 100ml

說明書 1 份

本系列產(chǎn)品目錄

1. 適用于各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應用

5. 產(chǎn)品性能指標

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準備

8. 各種動物單核細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

9. HES-TBD550 使用說明

10. 組織單細胞懸液的制備

11. 生產(chǎn)企業(yè)

1. 適用于各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索：：：

猴外周血單核細胞2. 注意事項

A． 本分離液是敏光型的,，在運輸和貯藏過程中應在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染,。另外,，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，

影響分離效果,。

B． 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮,，避免冷凍和冷藏,。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行,。

C． 由于各品牌離心機的性能不同,，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果,，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時間,，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）,。

D． 使用無靜電反應的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管,。

E． *抗凝劑選擇：EDTA,、枸櫞酸、肝素,。應注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑

體積,。

F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液,、細胞洗滌液及紅細

胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇,，本公司相關系列產(chǎn)品無菌,、無病毒、無支原體,、低內(nèi)

毒素水平且無細胞毒性,，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。

4. 應. 用

適用于從動物血液或臟器組織中分離單核細胞,。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下,，，,，

含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6. 貯藏及保存期限 6. 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存,，有效期兩年。啟封后置 4℃保存,，有效期一周,。

注：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存,。但應注意保存溫度較低時本分離液易

出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果。

7. 實驗前準備 7. 實驗前準備

A． 試劑

單核細胞分離液試劑盒所含試劑,、組織勻漿液,、羥乙已基淀粉 550、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管,、玻璃滴管

水平轉(zhuǎn)子離心機,、無菌工作臺

8. 各種動物 8. 各種動物單核細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 A、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）,；

B． 取 1ml新鮮抗凝血按1：1比例與全血及組織稀釋液混勻并小心疊加于D液之液面上,；或?qū)⒔M織單細胞懸液（細胞濃度為2×108

-1×109個/ml，制備方法詳見“10.組織單細胞懸液的制備方法”）疊加于D液之液面上,；

C. 以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子),；

此時離心管中由上至下細胞分為六層。*層,；為血漿（稀釋液）層,。第二層；,；,；為；單核

細胞層,。,。。第三層,；為透明 D 液層,。第四層,；為淋巴細胞層。第五層,；為透明 A 液層,。第六層；

為極少量紅細胞層,。收集第二層單核細胞放入含 4-5ml 細胞洗滌液的試管中,，充分混勻后，

以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘,，棄去上清留沉淀細胞重新懸起,。重復洗滌 2 次即得所需單核細胞。

注：：A. 提取率約為 80%,。

 B. 分離大量樣品時,，具體操作方法請參照我公司“淋巴細胞快速分離技巧”，查詢路徑：

登陸我公司,，在產(chǎn)品搜索中輸入您要的產(chǎn)品名稱→點擊查詢→或者直接我的客服,！

 血液（人）中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值：：： ：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個/mm3

)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個/mm3 紅細胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個/mm3

)

成人：4.0-10.0×109

/L(4000-10000 個/mm3

) 白細胞 新生兒：15.0-20.0×109

/L（15000-20000 個/mm3

)

血小板 100-300×109

/L（10 萬-30 萬個/mm3

)

名稱 占白細胞總數(shù)百分比 占白細胞總數(shù)百分比

嗜中性粒細胞 30%-70%

嗜酸性粒細胞 0.5%-5%

嗜堿性粒細胞 0%-1%

淋巴細胞 20%-40%

白細胞分類計數(shù)

單核細胞 3%-8% www.tbdscience.com

9. HES- 9. HES-TBD550 使用說明

HES 是從支鏈淀粉衍生出來的，是富含淀粉的復合物,，其生理和化學特性主要由羥乙已基

取代度即取代級,、平均分子量決定。大量實驗表明平均分子量越大對紅細胞的凝集作用越強,，

有效提高紅細胞的沉降速度,，從而使紅細胞與其它細胞分離。故而,，使用 HES-TBD550（羥

乙已基淀粉 550）沉淀法是一種高效的細胞分離方法,。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細胞、成脂肪細胞,、

骨髓基質(zhì)細胞,、肝臟細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等多種細胞分化的多潛能組織干細胞,是在

細胞治療,、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細胞,。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、

外周血中以及脂肪組織,、肌肉、胎兒器官,、大腦,、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離,、篩選,、

增殖,、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離,、擴增分化過程中操作技術等多種因

素有關,。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法,、流式細胞儀

法和免疫磁珠法,。流式細胞儀法對細胞損傷較大，免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體

反應也容易改變細胞原有特性,，而 HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結(jié)合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度,，目前研究多采用此法。國內(nèi)不少學者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細胞,，然后再進行離心分離單個核細胞,，也取得不錯結(jié)果。實驗

證明采用隨機數(shù)字表法,，將每份臍血隨機分入兩個不同處理組,，從而將臍血樣本的個體差異

減小到zui小程度。結(jié)果證實,，HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法,。本實驗采用的羥乙已基淀粉商品名為

HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550），克分子滲透壓為 308mosm／L,，膠體滲透壓為 68／36 mmHg,

可影響紅細胞集聚性沉降率,。紅細胞集聚是可遞性橋接結(jié)構形成的結(jié)果，由大的 HES-TBD550

（羥乙已基淀粉 550）分子處在紅細胞之間聯(lián)接而成,。HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）同時還

阻礙白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附,，并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低，從而有輕度抑制血小

板集聚的功能,。臍血經(jīng) HES-TBD550（羥乙已基淀粉 550）處理后,，可使紅細胞沉積至試管底，

對其它主要成分包括干細胞無影響,。經(jīng)這樣處理后,，實驗時間相對較短（平均為 1.5 h），

步驟相對較少,，細胞污染幾率小,，從而使細胞數(shù)損失減少。結(jié)論證明,，與相應的干細胞分離

液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細胞分離方法,。

10. 組織單細胞懸液的制備 10. 組織單細胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法，，,，酶消化法由于各實驗室選取的消化 ,，酶消化法由于各實驗室選取的消化酶種類各不相同，,，,，請各實驗室自行選擇進行試驗 ，請各實驗室自行選擇進行試驗,。,。。 ,。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境,。。,。 ,。

剪碎法：：：將組織塊放入平皿后 ： ，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清,；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀,，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿,，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內(nèi),；離心沉淀1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗3次,，每次以500rpm

短時低速離心除去細胞碎片,，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數(shù)并

調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml,。常溫下放置, 待測細胞的活力,。分離前用 20%胎牛血

清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊,；放入 70ml 組織研磨器內(nèi),，加入 2ml 組織勻漿液及 20%

胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動研棒,，研磨至勻漿,；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集

細胞懸液,，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾,；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液

洗 3 次,，離心沉淀,。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml,。常溫下放置, 待測

細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108

-1×109 個

/ml 的單細胞懸液備用,。

細胞計數(shù)方法:

細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）

進行,。既可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量,，也可用于

對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何,，均須制備分散的細胞懸液,。

計數(shù)與計算過程

1）、在細胞計數(shù)板*放置計數(shù)的蓋玻片,。

2）,、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液,，至

蓋玻片被液體充滿為止,。

3）、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù),。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者,，

對于細胞團按單個細胞計數(shù)。

4）,、按下式計數(shù)細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細胞計數(shù)要點：：： ：

A． 進行細胞計數(shù)時,，要求懸液中細胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中,；顯微鏡下計數(shù)時,，遇到 2 個以上細胞組成的細胞團，應按單個細

胞計算,。如果細胞團>10％,，說明細胞分散不充分; 或細胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2

時，說明稀釋不當,，需重新制備細胞懸液,。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性,。

C． 取樣計數(shù)前,，應充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混

勻,，以求計數(shù)準確,；

D． 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時,，只按照一個細胞計算,。如果細

胞壓在格線上時,，則只計上線，不計下線,，只計左線,，不計右線。

E． 操作時,，注意蓋玻片下不能有氣泡,，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù),。

初學者易犯的錯誤：：： ：

A． 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻,。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多,，至使細胞懸液流入旁邊的槽中,。

12. 參考文獻 12. 參考文獻

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