大鼠泰澤病原體ELISA試劑盒說明書

泰澤病原體試劑盒用于測定大鼠血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中泰澤病原體水平,。

實驗原理：

  本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標(biāo)本中大鼠泰澤病原體,。用純化的大鼠泰澤病原體抗體包被微孔板,，制成固相抗體，可與樣品中泰澤病原體抗原相結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與HRP標(biāo)記的泰澤病原體抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，與CUTOFF值相比較,，從而判定標(biāo)本中大鼠泰澤病原體的存在與否。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟：

1.         編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號,，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔,、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）

2.         加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照,、陽性對照50μl,。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。  

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

5.         洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

6.         加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。

7.         溫育：操作同3,。

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl,，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘

10.     終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.     測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果判定：

  試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.15

  臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.20

  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為大鼠泰澤病原體陰性

  陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為大鼠泰澤病原體陽性

注意事項

1．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,，本試劑不同批號組分不得混用,。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。

4．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

5．底物請避光保存,。

6．試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時,，參考波長為630nm

7．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,，使用時必須注意安全,。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃,。

2．有效期：6個月

大鼠白三烯B5（LTB5）elisa檢測試劑盒