操作說明 細胞分離液試劑盒操作說明::::
Store at:::RT 試劑盒規(guī)格::::2×100ml/Kit
兔胰島細胞分離液試劑盒試劑盒內容:
全血及組織稀釋液 100ml
細胞洗滌液 100ml
試劑 B 100ml
試劑 D 100ml
說明書 1 份
一、,、,、,、分離方法說明及圖例
A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B,、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面(各液面分層一定要清晰),;
B.取 1ml新鮮抗凝血與全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)1:1混合并小心加于D液之液面上,;或取組織勻漿單細胞懸液(細胞濃度為2×108-1×109個/ml,,具體制備方法參照
“二、組織單細胞懸液的制備”)小心加于D液之液面上,;
C. 以400g(約1500轉/分)離心15分鐘(半徑15cm水平轉子),;
此時離心管中由上至下細胞分為五層。*層,;為血漿層或組織勻漿液層,。第二層;為
富含胰島細胞的 D 液層,。,。。,。第三層,;為單個核細胞層。第四層,;為透明 B 液層,。第五層;為紅細胞層,。收集第二層富含胰島細胞的 富含胰島細胞的 富含胰島細胞的 D 液層放入含 4-5ml 細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20 分鐘,,棄去上清留沉淀細胞重新懸起,。重復洗滌 2 次即得所需胰島細胞。
注::::A. 提取率約為 80%,。
注::::A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法,,,,,,酶消化法由于各實驗室選取的消化 酶消化法由于各實驗室選取的消化酶種類各不相同,, 酶種類各不相同,,,,,請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗,。。。,。全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境,。。,。,。 剪碎法::::將組織塊放入平皿后,加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清,;用眼科剪將組織剪至勻漿狀,,加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清;用吸管吸取組織勻漿,,用 100 目不銹鋼濾網
(另購)過濾到試管內,;離心沉淀 1500轉/分×3 min,再用細胞洗滌液清洗 3次,,每次以 500rpm短時低速離心除去細胞碎片,,以 200 目不銹鋼濾網(另購)過濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為(2~5)×107個/ml,。常溫下放置, 待測細胞的活力,。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。
勻漿器法:用眼科剪將組織剪成小塊,;放入 70ml 組織研磨器內,,加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清;緩慢轉動研棒,,研磨至勻漿,;用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器;收集細胞懸液,,經 200 目不銹鋼濾網(另購)過濾,;離心沉淀 800rpm×2min ,再用細胞洗滌液洗 3 次,,離心沉淀,。作細胞計數并調整細胞濃度為(2~5)×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力,。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109 個/ml 的單細胞懸液備用,。 細胞計數方法: 細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板(血球計數板)進行,。既可用于分離(散)細胞培養(yǎng)接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,,也可用于
對培養(yǎng)物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何,,均須制備分散的細胞懸液,。
1),、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。
2),、用玻璃虹吸管吸取細胞,,讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液,至
蓋玻片被液體充滿為止,。
3),、置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者,,
對于細胞團按單個細胞計數,。
4)、按下式計數細胞懸液的密度:
細胞密度=(4 個大格細胞總數/4)×104個/ml×稀釋倍數
公式中乘以 104因為計數板中每一個大格的體積為:
1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3
而 1ml=1000mm3
細胞計數要點::::
A. 進行細胞計數時,,要求懸液中細胞數目不低于 104個/ml,,如果細胞數目很少要進行離
心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;顯微鏡下計數時,,遇到 2 個以上細胞組成的細胞團,,應按單個細胞計算。如果細胞團>10%,,說明細胞分散不充分; 或細胞數<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時,,說明稀釋不當,需重新制備細胞懸液,。
B. 要求細胞懸液中的細胞分散良好,,否則影響計數準確性。
C. 取樣前充分混勻細胞懸液,,尤其多次取樣更要注意每次取樣都要混勻,,以求計數準確;
D. 數細胞的原則是只數完整的細胞,,若細胞聚集成團時,,只按照一個細胞計算。如果細
胞壓在格線上時,,則只計上線,,不計下線,只計左線,,不計右線,。
E. 操作時,注意蓋玻片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數,。
初學者易犯的錯誤: 初學者易犯的錯誤:::
A. 計數前未將待測懸液吹打均勻,。
B. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡,。
C. 滴入懸液時的量太多,至使細胞懸液流入旁邊的槽中,。
三,、、,、,、注意事項
A. 本分離液是敏光型的,運輸和貯藏過程中在 18℃-25℃避光保存,,啟封后 4℃保存本品只能用于科學研究,,不能用于臨床檢測
避免微生物污染。本品為真空包裝,,未啟封前于 10℃ 以下易出現白色結晶,,影響分離效果。
B. 待分離的血液及組織樣本要求新鮮,,避免冷凍和冷藏,。分離液和所分離樣本一定在
20℃水浴箱中復溫 20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在 20℃±2℃時分離效果,且
所有操作過程一定要在無菌條件下進行,。
C. 由于各品牌離心機的性能不同,,國內南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季差異,可能影響分離
效果,,用戶可調節(jié)離心轉數及離心時間,,摸索*的分離條件(具體分離條件各實驗室自定)。
D. 使用無靜電反應的離心管,,推薦使用未經過堿處理的玻璃離心管,。
E. *抗凝劑選擇:EDTA、枸櫞酸,、肝素,。注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑體積。
F. 分離過程中所用其他試劑如:羥乙一基淀粉 550,、全血及組織稀釋液,、細胞洗滌液及
紅細胞裂解液等以我公司產品為*選擇,本公司相關系列產品無菌,、無病毒,、無支原體、
低內毒素水平且無細胞毒性,,所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài),。
四、,、,、,、 產品性能指標
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內毒素 ≤0.5...EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下
五、,、,、、 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限
18℃-25℃避光保存,,有效期兩年,。啟封后置 4℃保存,有效期一周,。
注::::若保證無微生物污染,,啟封后可置 4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現白色結晶,,影響分離效果,。
貨號 品牌 產品名稱 規(guī)格 報價
血管內皮細胞分離液試劑盒 | ||||
VE2011H | TBD | 人血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011RAT | TBD | 大鼠血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011M | TBD | 小鼠血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011R | TBD | 兔血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011D | TBD | 狗血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011B | TBD | 牛血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011G | TBD | 豚鼠血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011C | TBD | 雞血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VEHY2011M | TBD | 猴血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VEHY2011P | TBD | 豬血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VEHY2011H | TBD | 馬血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
VE2011G | TBD | 羊血管內皮細胞分離液試劑盒 | 4*50ml | 600 |
2010C1119 | TBD | 全血及組織勻漿稀釋液 | 500ml | 140 |
2010X1118 | TBD | 細胞洗滌液 | 500ml | 140 |