操作說明 細(xì)胞分離液試劑盒操作說明：：：：

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：2×100ml/Kit

大鼠胰島細(xì)胞分離液試劑盒試劑盒內(nèi)容：

全血及組織稀釋液 100ml

細(xì)胞洗滌液 100ml

試劑 B 100ml

試劑 D 100ml

說明書 1 份

一、,、,、,、分離方法說明及圖例

A. 在 10ml 或 15ml 玻璃離心管中依次小心加入 B,、D 兩種液體各 2ml,制成梯度界面（各液面分層一定要清晰）,；

B．取 1ml新鮮抗凝血與全血及組織稀釋液（Cat#：2010C1119）1：1混合并小心加于D液之液面上,；或取組織勻漿單細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為2×108-1×109個/ml,，具體制備方法參照

“二、組織單細(xì)胞懸液的制備”）小心加于D液之液面上,；

C. 以400g（約1500轉(zhuǎn)/分）離心15分鐘(半徑15cm水平轉(zhuǎn)子),；

此時離心管中由上至下細(xì)胞分為五層。*層,；為血漿層或組織勻漿液層,。第二層；為

富含胰島細(xì)胞的 D 液層,。,。。,。第三層,；為單個核細(xì)胞層。第四層,；為透明 B 液層,。第五層；為紅細(xì)胞層,。收集第二層富含胰島細(xì)胞的 富含胰島細(xì)胞的 富含胰島細(xì)胞的 D 液層放入含 4-5ml 細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）的試管中,，充分混勻后，以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 20 分鐘，棄去上清留沉淀細(xì)胞重新懸起,。重復(fù)洗滌 2 次即得所需胰島細(xì)胞,。

注：：：：A. 提取率約為 80%。

注：：：：A.. .. 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法,，,，，,，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化酶種類各不相同,， 酶種類各不相同，,，,，請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。,。,。。全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境,。,。。,。 剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后,，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀,，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清,；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)

(另購)過濾到試管內(nèi),；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min,，再用細(xì)胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm短時低速離心除去細(xì)胞碎片,，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細(xì)胞團(tuán)塊,。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力,。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細(xì)胞懸液備用,。

勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi),，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清,；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿,；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器,；收集細(xì)胞懸液,，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ,，再用細(xì)胞洗滌液洗 3 次,，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個/ml,。常溫下放置, 待測細(xì)胞的活力,。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109 個/ml 的單細(xì)胞懸液備用。 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法: 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法,。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行,。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于

對培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù),。不論計(jì)數(shù)的對象如何,，均須制備分散的細(xì)胞懸液。

1）,、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）,、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞,，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止,。

3）,、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者,，

對于細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計(jì)數(shù),。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3

 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：：：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時,，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個/ml,，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時,，遇到 2 個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),，應(yīng)按單個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％,，說明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時,，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液,。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣前充分混勻細(xì)胞懸液,，尤其多次取樣更要注意每次取樣都要混勻,，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確,；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時,，只按照一個細(xì)胞計(jì)算,。如果細(xì)

胞壓在格線上時，則只計(jì)上線,，不計(jì)下線,，只計(jì)左線，不計(jì)右線,。

E． 操作時,，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中,，否則要重新計(jì)數(shù),。

初學(xué)者易犯的錯誤： 初學(xué)者易犯的錯誤：：：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡,。

C． 滴入懸液時的量太多,，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

三,、,、、,、注意事項(xiàng)

A． 本分離液是敏光型的,，運(yùn)輸和貯藏過程中在 18℃-25℃避光保存，啟封后 4℃保存本品只能用于科學(xué)研究,，不能用于臨床檢測

避免微生物污染,。本品為真空包裝，未啟封前于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果,。

B． 待分離的血液及組織樣本要求新鮮，避免冷凍和冷藏,。分離液和所分離樣本一定在

20℃水浴箱中復(fù)溫 20 分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在 20℃±2℃時分離效果,，且

所有操作過程一定要在無菌條件下進(jìn)行。

C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同,，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季差異,，可能影響分離

效果，用戶可調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)及離心時間,，摸索*的分離條件（具體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）,。

D． 使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管,。

E． *抗凝劑選擇：EDTA,、枸櫞酸,、肝素。注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑體積,。

F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙一基淀粉 550,、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇,，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌,、無病毒、無支原體,、

低內(nèi)毒素水平且無細(xì)胞毒性,，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

四,、,、、,、 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

五,、、,、,、 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限

18℃-25℃避光保存，有效期兩年,。啟封后置 4℃保存，有效期一周,。

注：：：：若保證無微生物污染,，啟封后可置 4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,，影響分離效果,。

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