人細(xì)胞凋亡酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）

試劑盒使用說明書

l       僅用于科研,，不得用于臨床診斷,！

l       用于定量檢測人血清、血漿及其他相關(guān)液體樣本中細(xì)胞凋亡的含量,。

l       有效期：6個月,。

l       保存條件：2-8℃

使用前請仔細(xì)閱讀說明書！

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用生物素雙抗體夾心法測定樣品中人細(xì)胞凋亡水平,。向預(yù)先包被了人細(xì)胞凋亡單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入細(xì)胞凋亡,，溫育；溫育后,，加入生物素標(biāo)記的抗細(xì)胞凋亡抗體,。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物,，再經(jīng)過溫育和洗滌,，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細(xì)胞凋亡呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人細(xì)胞凋亡的濃度。

試劑盒組成

注意事項：

1．  試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．  濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。

3．  各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）,。

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6．  底物請避光保存,。

7．  嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．  所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．  本試劑不同批號組分不得混用。

需要而未提供的試劑和器材：

1．    37℃恒溫箱,。

2．    標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀,。

3．    精密移液器及一次性吸頭

4．    蒸餾水，

5．    一次性試管

6．    吸水紙

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。,。

操作程序

1.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋,。）

2.       根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。

3.       將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度由高到低或者由低到高依次加入酶標(biāo)包被板孔中,。

4.       分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品,、生物素標(biāo)記的抗Apoptosis抗體及鏈霉親和素-HRP,，其余各步操作相同）及待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl,，然后再加生物素標(biāo)記的抗Apoptosis抗體10μl。加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。

5.       溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

6.       配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。

7.       洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干,。

8.       加酶：每孔加入鏈霉親和素-HRP 50μl，空白孔除外,。

9.       溫育：操作同5,。

10.    洗滌：操作同7,。

11.    顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

12.    終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

13.    測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

實驗操作流程圖：

計    算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)      準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋     

倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。                                

人金屬蛋白酶組織抑制因子-2（TIMP-2）ELISA試劑盒說明書