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DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書
DNAFect Transfection Reagent
目錄號(hào):YJ0860
保存:2-8℃
組分說明
Catalogno. YJ0860 YJ0860A
KitSize 0.5 ml 1 ml
DNAFect Transfection Reagent 0.5 ml 1 ml
產(chǎn)品簡介
DNAFect是一種的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,,適用于多種細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染,。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系包括原代細(xì)胞都有較高的轉(zhuǎn)染效率,,并且對(duì)細(xì)胞毒性極低,。本轉(zhuǎn)染試劑可應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染,、高通量DNA轉(zhuǎn)染,,基因表達(dá)和基因功能研究。
注意事項(xiàng)
1.轉(zhuǎn)染試劑使用前應(yīng)先震蕩搖勻,。
2.轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞密度有很大關(guān)系,,不同實(shí)驗(yàn)間應(yīng)保持一個(gè)基本的傳代步驟,確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期,。
一般貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染的*細(xì)胞密度是80-90%,,懸浮細(xì)胞的*細(xì)胞密度為3-5×10 5細(xì)胞/ml,,用于轉(zhuǎn)染的*細(xì)胞密度
3. 轉(zhuǎn)應(yīng)染根據(jù)不同的時(shí)不要在培細(xì)養(yǎng)胞基中加入抗生素,,否類型或用途而異。則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,。
操作步驟
對(duì)于大部分的細(xì)胞系,, DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。為了提高轉(zhuǎn)化效率,、表達(dá)水平并且減少細(xì)胞毒性,,實(shí)驗(yàn)應(yīng)在細(xì)胞密度較大時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以下操作以24孔板每孔細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例,。
1. 貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)化前一天,,在24孔板的每孔中加入500 μl無抗生素的生長培養(yǎng)基,并于每孔中接種0.5-2×105 個(gè)細(xì)懸浮細(xì)胞:在胞,,待細(xì)胞轉(zhuǎn)細(xì)染之前,,在胞長至80-90%24孔板的滿時(shí)進(jìn)每行孔中加入轉(zhuǎn)染。500μl無抗生素的生長培養(yǎng)基,,并于每孔中接種3-5×10 5個(gè)細(xì)胞,。
2. 轉(zhuǎn)染當(dāng)天,首先準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,,對(duì)于每孔細(xì)胞按照以下用量配制:
a. 取適量DNA,,加入25 μl無血清培養(yǎng)基,,并輕輕的混合均勻。
b. 取適量DNAfect,,加入25 μl無血清培養(yǎng)基,,輕輕混勻,并于室溫孵育5分鐘,。
c. 孵育5分鐘之后,,將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合(使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl),輕輕混合均勻,,并在室溫下孵育20分鐘(溶液可能會(huì)出現(xiàn)絮狀,,但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率)
注意:該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時(shí)。
3. 將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞生長培養(yǎng)基更換成450 μl無血清培養(yǎng)基,,然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24細(xì)胞孔板內(nèi),,輕輕前后推動(dòng)24孔板以混勻。
4. 將細(xì)胞置于含5%CO2,,37℃條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)后,,更換成500 μl生長培養(yǎng)基。
5. 18-48小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的檢測(cè),。
6. 對(duì)于穩(wěn)定的細(xì)胞系:在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,,細(xì)胞按照1:10的比例傳代,第二天可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,。
注:(1) 該說明為一個(gè)24孔的用量,,若同時(shí)轉(zhuǎn)幾個(gè)孔,配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍,;若轉(zhuǎn)染其他類型孔板,,DNA和DNAfect用量見附表,
該附表用量以293T細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)用量,。
(2) 轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后也可以不更換生長培養(yǎng)基,,但由于DNAfect具有一定的細(xì)胞毒性,作用時(shí)間過長可能使某些細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象,,建議更換生長培養(yǎng)基,。
(3) 優(yōu)化條件:想要得到更高的轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件:培養(yǎng)物,、DNA濃度,、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞與DNA復(fù)合物的孵育時(shí)間等條件都應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。
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