呋喃唑酮代謝物

快速檢測試劑盒說明書

一,、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物呋喃唑酮代謝物將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物抗體,，加入酶標記物后,，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物呋喃唑酮代謝物的含量成負相關(guān),，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃唑酮代謝物的含量,。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.01ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min~15min

• 樣本檢測下限

肌肉組織   ·································   0.05ppb

雞蛋    ·······································  0.05ppb

蜂蜜   ·········································  0.05ppb 

• 交叉反應(yīng)率

呋喃唑酮代謝物 ·································  100%

呋喃它酮代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃妥因代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃西林代謝物 ·······························  ＜0.1%

• 樣本回收率

肌肉組織   ·································  95%±25%

雞蛋    ······································  95%±25%

蜂蜜   ·······································  85%±23%

三,、試劑盒組成

四、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標儀,、均質(zhì)器、振蕩器,、離心機,、刻度移液管、天平（感量0.01g）,、氮吹儀,、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20~200µl,、單道100~1000µl,、多道 30~300 µl

試      劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O,、正己烷,、乙酸乙酯,、濃HCl

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時要更換吸頭,。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔,，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。

• 樣本前處理需配制

配液1  0.1M K₂HPO₄溶液：

稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml。

配液2  1M HCl 溶液：

取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml,。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml

配液4  樣本復溶液：

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋,。

• 樣本處理

（a）肌肉,、雞蛋樣本處理方法

稱取1±0.05g的均質(zhì)物,，分別加入4ml的蒸餾水,，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑，充分振蕩2min,；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h),；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,，充分振蕩30s,；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心,；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復離心）,；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干。

用2ml正己烷溶解干燥物,，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s,；在室溫下4000r/min以上離心10min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min,，重復離心）；

取50µl下層用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍

（b）蜂蜜樣本處理方法

稱取2±0.05g的均質(zhì)物（蜂蜜）,，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,，充分振蕩2min,；

在37℃過夜孵育（大約16h）或56℃水浴中孵育(2h)；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液,，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復離心,；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時間重復離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個容器中于50℃氮氣/空氣吹干,；

用2ml正己烷溶解干燥物,，再加入1ml樣本復溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min,；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復離心）,；

取50µl下層用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點,。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2-8℃,。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標準品/樣品50µl/孔到各自的微孔中,，加入酶標記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板,，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
• 將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次,，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔,，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min,。
• 測定：加入終止液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，5min內(nèi)讀數(shù)）,，測定每孔OD值。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物量成負相關(guān),。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.01ppb為1.816,；0.03ppb為1.415；0.09ppb為0.74,；0.27ppb為0.313,；0.81ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.27ppb～0.81ppb,；樣本2的濃度范圍是0.03ppb～0.09ppb,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計算,，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%,，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標,，以呋喃唑酮代謝物標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物實際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來索?。?/span>

八,、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會伴隨著標準曲線不成線性,，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作,。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封,；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時,，表示試劑可能變質(zhì),。
• 該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣,，酶標板仍然正常有效,，不影響實驗結(jié)果，請放心使用,。

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