呋喃它酮代謝物

快速檢測試劑盒說明書

一,、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,，樣本中的殘留物呋喃它酮代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃它酮代謝物抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含殘留物呋喃它酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物呋喃它酮代謝物的含量。

二,、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.03ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時(shí)間：       30min~15min

• 樣本檢測下限

組  織    ·······································  0.1ppb

雞  蛋    ·······································  0.1ppb

• 交叉反應(yīng)率

呋喃它酮代謝物 ·································  100%

呋喃唑酮代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃妥因代謝物 ·······························  ＜0.1%

呋喃西林代謝物 ·······························  ＜0.1%

• 樣本回收率

組  織    ···································  95%±25%

雞  蛋    ···································  95%±25%

三,、試劑盒組成

四,、所用儀器,、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器,、振蕩器,、離心機(jī)、刻度移液管,、天平（感量0.01g）,、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋

微量移液器：單道 20~200µl,、單道100~1000µl,、多道 30~300 µl

試      劑：氫氧化鈉、K₂HPO₄·3H₂O,、正己烷,、乙酸乙酯、濃HCl

五,、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

• 樣本前處理需配制

配液1  0.1M K₂HPO₄溶液：

稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml,。

配液2  1M HCl 溶液：

取8.6ml濃HCl加去離子水定容至100ml,。

配液3  1M NaOH溶液：

稱4g NaOH加去離子水定容至100ml

配液4  樣本復(fù)溶液：

將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。

• 樣本處理

肌肉組織,、雞蛋樣本處理方法

稱取1±0.05g的均質(zhì)物,，分別加入4ml的蒸餾水，0.5ml 1M HCl溶液和100µl衍生化試劑,，充分振蕩2min,；

在70℃水浴鍋中孵育20min；

分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄溶液,，0.4ml 1M NaOH溶液和6ml乙酸乙酯,，充分振蕩30s；

在室溫下（20-25℃）4000r/min以上離心10min（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足 3ml ,，在 80 ℃ 水浴孵育樣品10min 并重復(fù)離心,；或提高轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間重復(fù)離心）；

取出3ml的乙酸乙酯到另一個(gè)容器中于50℃氮?dú)?/span>/空氣吹干,。

用2ml正己烷溶解干燥物,，再加入1ml樣本復(fù)溶液充分混合30s；在室溫下4000r/min以上離心10min,；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,，則去除上層正己烷后于70℃水浴10-20min，重復(fù)離心）,；

取50µl下層用于分析,。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍 

此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物,、呋喃西林代謝物,、氯霉素試劑盒可合一處理,。

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）,。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn),。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射,，用蓋板膜蓋住微孔板,。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上,，注意每種液體試劑使用前均須搖勻,。
• 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋,，保存于2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水）,，或按所需用量配制洗滌液,。
• 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
• 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50µl/孔,，然后再加入抗體工作液50µl/孔,，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30min,。
• 將孔內(nèi)液體甩干,，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔,，輕輕振蕩混勻,，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)）,，測定每孔OD值,。

七,、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法,，定量判定用第2種方法,。注意樣本吸光度值與其所含呋喃它酮代謝物量成負(fù)相關(guān)。

1,、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml),。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0,，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243,； 0.03ppb為1.816；0.09ppb為1.415,；0.27ppb為0.74,；0.81ppb為0.313；2.43ppb為0.155,。則樣本1的濃度范圍是0.81ppb～2.43ppb,；樣本2的濃度范圍是0.09ppb～0.27ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃它酮代謝物實(shí)際濃度,。

2,、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值,，再乘以100%,，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃它酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃它酮代謝物實(shí)際濃度,。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析,。（歡迎索取）

八,、 注意事項(xiàng)

• 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
• 混合要均勻,，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸,，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒,；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度,、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑,。
• 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封,；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下,。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),，表示試劑可能變質(zhì),。
• 該試劑盒ZUI佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化,。

九,、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍,。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，請放心使用,。

萊克多巴胺快速檢測試劑盒說明書