一,、稱取
用度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品。先根據(jù)配方計(jì)算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量,，然后用天平稱取,。稱量時(shí)用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。稱量紙折疊方法如圖所示,。
二,、溶化
培養(yǎng)基放入燒杯或搪瓷缸中，慢慢加入少量所需水,，邊加入邊用玻棒攪拌,。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂，培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂,，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸,，溶解后，再補(bǔ)齊所需水,，并攪拌均勻(如圖3所示),。如果配制的培養(yǎng)基量很大,，可用不銹鋼鍋加熱溶化，可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng),，防止焦化，如有焦化現(xiàn)象,，配制的培養(yǎng)基就不能使用，要重新配制,。
配制培養(yǎng)基時(shí)不可用銅或鐵的容器溶化,，因銅或鐵制容器可能會(huì)使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量標(biāo)，影響實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L,，細(xì)菌不宜生長(zhǎng)，鐵含量過(guò)0.14mg/L,，妨礙細(xì)菌產(chǎn)毒素),。對(duì)容易發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀的藥品,，要分開(kāi)溶解,，后加入培養(yǎng)基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂,。
三、調(diào)pH
雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分,，能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi),，但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求，就要進(jìn)行必要的調(diào)整,。如果有已校準(zhǔn)pH計(jì),，可用pH計(jì)，如果沒(méi)有,，可用精密的pH試紙,，再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸)調(diào)制所需的pH。培基的pH一般為7.4～7.6,，也有酸性或堿性的,。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基，在調(diào)整pH時(shí)要調(diào)至高出所需0.1個(gè)～0.2個(gè)單位,，因用氫氧化鈉調(diào)整時(shí),，高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2,。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分,，可不pH,。
四、過(guò)濾
配成的培養(yǎng)基,，若無(wú)特殊要求，可省略此步,。若有沉淀或渾濁.需要澄清的.液體培養(yǎng)基可用油紙過(guò)濾。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過(guò)濾,。如果過(guò)濾法還不能達(dá)到澄清的要求,，則可用蛋清澄清法，即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃,，裝入三角瓶?jī)?nèi)(不過(guò)容量的二分之一),，按1000mL加人1個(gè)～2個(gè)雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min,，高壓蒸汽滅菌121℃,、20min，取出趁熱過(guò)濾即可,。
五,、分裝
配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中,，分裝試管,，如果試管量很大，可用自動(dòng)分液器,，如果試管量少,，可用漏斗分裝。分裝量不過(guò)容器容積的三分之二,。三角瓶以不過(guò)容積的二分之一為宜;瓊脂斜面以不過(guò)試管長(zhǎng)度的五分之一為宜,，滅菌后，擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一,，底層為三分之二的量為宜;半固體瓊脂分裝量為試管長(zhǎng)度的三分之一;用來(lái)接種或保菌的高層瓊脂,，分裝量為試管長(zhǎng)度的四分之一或三分之一，用來(lái)接種厭氧菌的要達(dá)到三分之二;瓊脂平板,，內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜,，內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多,，可將平板倒扣,，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min，干燥后再用,。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝一小玻璃瓶(約20mL)與該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌,，為測(cè)定該批培養(yǎng)基終pH,。
六、滅菌
分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)立即進(jìn)行滅菌,。滅菌的方法種類如下：
1. 高壓蒸汽滅菌法
大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法,，小量分裝時(shí)，用121℃,，15min;滅菌量大時(shí),，用121℃，30min滅菌;含糖類的培養(yǎng)基只能113~115℃,，15min滅菌,，避免糖類遭破壞。
2.煮沸滅菌法
對(duì)含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基,，可使用此方法,。
3.過(guò)濾除菌
以過(guò)濾的方法除菌，用無(wú)菌操作技術(shù),，定量加入培養(yǎng)基,。血液、抗生素可用無(wú)菌操作技術(shù)抽取,，加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中,。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時(shí)，可用此法,。
對(duì)LST培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí),，有時(shí)發(fā)酵管內(nèi)會(huì)有氣泡。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡,，可以采取以下幾項(xiàng)措施：
1. 小倒管浸滿培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛LST的試管中,。
2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前，將鍋內(nèi)氣體排干凈,。
3.試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時(shí)候),，勿使用橡皮塞。
4不要過(guò)早打開(kāi)滅菌鍋,，要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時(shí)再打開(kāi)滅菌鍋,。
如果以上情況都做到還有氣泡，可用水做培養(yǎng)基組的對(duì)照試驗(yàn),，若培養(yǎng)基組有氣泡,，而對(duì)照組沒(méi)有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因。
七,、倒平板
滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后,，倒入無(wú)菌干燥的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基的溫度不能過(guò)高，否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低,，培養(yǎng)基又容易凝固成塊,，無(wú)法制成平板。倒平板時(shí),，應(yīng)在靠近酒精燈火焰進(jìn)行,，以免外界的雜菌落入平板內(nèi)，左手拿培養(yǎng)皿,，右手拿三角瓶的底部,，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼燒瓶口,，用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開(kāi)一條縫，至瓶口剛好伸入,，倒入培養(yǎng)基,，以鋪滿底為限，不過(guò)培養(yǎng)皿高度的三分之一,，迅速蓋好蓋,，放在桌面上，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,，使培養(yǎng)基分布均勻,，冷凝后即可。
八,、擺斜面
裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基,，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上,，并成適當(dāng)?shù)男倍?，冷卻后，瓊脂凝固即成斜面,。斜面長(zhǎng)度不用過(guò)試管二分之一,。
九、質(zhì)量檢查
培養(yǎng)基滅菌后仔細(xì)檢查一遍,，發(fā)現(xiàn)有破裂,、水分浸入、色澤異常,、棉塞被培養(yǎng)基沾染,，都要丟棄，不能再用,。并測(cè)定其終pH,。還需進(jìn)行無(wú)菌檢查和效果檢查。無(wú)菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)~2管(瓶),，37℃恒溫培養(yǎng)1d～2d,，確定無(wú)雜菌生長(zhǎng);效果檢查是用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長(zhǎng),、形態(tài)及生化情況，與已知情況相符,。兩種情況都合格,，配制的培養(yǎng)基方可使用。
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