scarabgenomics C-0742說明書

MDS™42 Chemically Competent Cell Kit

• 維持和繁殖不穩(wěn)定的克隆和質(zhì)粒 - 攜帶直接重復(fù)序列,，反向重復(fù)序列或?qū)е旅黠@的二級“莖 - 環(huán)”結(jié)構(gòu)的其他序列的pDNA載體在標準大腸桿菌宿主中通常是不穩(wěn)定的。CleanGenome® 大腸桿菌菌株經(jīng)常用于克隆在其他菌株中遭受不需要的重組事件的序列,。
• 準確的質(zhì)粒復(fù)制 - 從CleanGenome® 大腸桿菌菌株中刪除了重組或移動DNA元件,，如插入元件，以確保您的構(gòu)建體的忠實復(fù)制,。
• 克隆和表達“有害”基因 - 清除Genome® 大腸桿菌菌株的自然防御系統(tǒng),，例如IS變異“有害”基因以阻止對生物體的壓力，已被刪除,，因此它們不會干擾您的實驗,。

背景

使用合成生物學(xué)方法，通過進行一系列計劃的,，的缺失來減少大腸桿菌K-12基因組,。多重缺失系列（MDS™）菌株（1），基因組減少高達15％,，通過鑒定非必需基因和消除序列,，包括重組或移動DNA和神秘毒力基因，同時保持強勁生長而設(shè)計和蛋白質(zhì)生產(chǎn),?；蚪M減少還導(dǎo)致意想不到的有益特性，包括高電穿孔效率和重組基因和在其他菌株中不穩(wěn)定的質(zhì)粒的準確繁殖,。隨后的缺失和有用等位基因的引入產(chǎn)生適合于許多分子生物學(xué)應(yīng)用的菌株,。

圖1：多個缺失菌株耐受“有害”基因,。 
由霍亂毒素B亞單位（CTX）融合的兔出血癥病毒VP60組成的嵌合基因在大腸桿菌中非常不穩(wěn)定。單獨地,，兩個基因在E中都是穩(wěn)定的,。大腸桿菌HB101，C600和DH10B,，但在相同宿主中攜帶融合基因的pCTXVP60不產(chǎn)生融合蛋白,，并且以低產(chǎn)率回收,。所有回收的質(zhì)粒都含有CTXVP60開放閱讀框中的突變,，幾乎全部來自IS插入。相反,，重組質(zhì)粒在MDS TM中*穩(wěn)定; 獲得了正常的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量,。pCTXVP60的代表性限制性模式。（A）將來自MDS TM 42的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化并在的宿主中繁殖,，然后用NcoI和EcoRI消化,。純化每個限制性模式的代表并測序。M,，分子量標記,，1 kbp階梯; 1，MDS™41,，無插入; 2,，MDS™42，無插入; 3,，DH10B,，IS 10插入; 4，DH10B,，IS 10插入/缺失; 5,，C600，IS5插入; 6,，C600,，IS1插入; 7，C600,，IS 1插入,。（B）對于所呈現(xiàn)的五個實例確定的CTXVP60閱讀框中IS元件插入位點的相對位置。

圖2：不同宿主菌株中的質(zhì)粒穩(wěn)定性,。 
左：在pT-ITR的四次傳代培養(yǎng)期間,，具有病毒LTR區(qū)段的質(zhì)粒; 泳道0，傳代培養(yǎng)前分離的質(zhì)粒DNA,，泳道1-4,，連續(xù)傳代培養(yǎng),。用限制酶消化質(zhì)粒DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析,。KpnI在單個位點切割質(zhì)粒,，但在MG1655中，兩個條帶表明質(zhì)粒缺失,。MscI在兩個位置切割,，但在MG1655中，第三個中間帶確認質(zhì)粒被刪除,。右圖：慢病毒表達質(zhì)粒的四種變體在MDS TM42ΔrecA和Stbl3 TM（Life Technologies）中的穩(wěn)定性,，顯示含有完整質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體的比例（表2 BioTechniques 43：466-470（2007年10月））（2）。

試劑盒組分 
MDS™42個化學(xué)感受態(tài)細胞
的pUC19對照DNA（10微克/微升）
的SOC培養(yǎng)基

基因型 
MG1655多缺失菌株（1）
所述的recA基因 1819突變是Δ的*缺失的recA,。
已經(jīng)在基因組中產(chǎn)生了lacZ M15缺失,，以允許使用β-半乳糖苷酶的α-互補片段對質(zhì)粒中的插入物進行藍/白篩選。

質(zhì)量控制 
使用pUC19對照DNA測試轉(zhuǎn)化效率,，一式兩份進行,。將轉(zhuǎn)化的細胞接種在含有50μg/ ml羧芐青霉素的LB平板上。轉(zhuǎn)化效率= 1×10 ⁸cfu /μgDNA,。

儲藏條件 
將組件儲存在-80°C,。不要將細胞儲存在液氮中。

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