ALSTEM是一家位于灣區(qū)的早期生物技術(shù)公司,，擁有快速擴(kuò)展的產(chǎn)品和服務(wù)組合,，為生物制藥和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)提供服務(wù),。受到加利福尼亞干細(xì)胞研究承諾的啟發(fā),，ALSTEM于2012年由具有iPS細(xì)胞重編程和基因組編輯技術(shù)專業(yè)知識(shí)的科學(xué)家創(chuàng)立,。

ALSTEM VP200說明書

Retroviral Packaging Mix: #VP200

逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物：＃VP200

描述

逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物提供了一種快速方便的方法，用于產(chǎn)生高滴度的無復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒,。這種基于Moloney鼠白血病病毒（MMLV）的包裝系統(tǒng)擁有您的靶細(xì)胞所需的理想宿主范圍,。它是一種即用型逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物，含有VSVG,，僅需48小時(shí)即可產(chǎn)生高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒,。這些必需的病毒結(jié)構(gòu)基因的單獨(dú)表達(dá)通過小化細(xì)胞分裂過程中產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)并降低產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒的機(jī)會(huì)來確保對(duì)重組構(gòu)建體的安全性和控制。

• 概觀

逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物是用于產(chǎn)生高滴度泛熱反轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)化配方,。

• 通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)10 ^7個(gè)感染單位/ ml的平均滴度
• 簡(jiǎn)單共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物和含有您感興趣的基因的表達(dá)載體
• 產(chǎn)生自我失活的泛熱反轉(zhuǎn)錄病毒

第1天：

1.在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞（每10cm培養(yǎng)皿約4×10 ^6個(gè)細(xì)胞）,。

第2天：

2.檢查以確保細(xì)胞達(dá)到70-80％匯合。

3.對(duì)于每個(gè)10cm培養(yǎng)皿,，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物如下：

一個(gè),。1.5ml試管A：在0.5ml無血清培養(yǎng)基（例如DMEM）中稀釋7.5μgDNA質(zhì)粒和15μl逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝混合物。通過移液混合,。

灣 1.5ml離心管中B：稀釋NanoFect的45μL ^TM轉(zhuǎn)染試劑在0.5ml無血清培養(yǎng)基中并輕輕混合,。

C。將NanoFect / DMEM添加到DNA / DMEM溶液中,。通過渦旋混合5-10秒,，然后在室溫下孵育DMEM-質(zhì)粒-NanoFect混合物15分鐘。

4.將來自步驟3的完整轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴添加至細(xì)胞,，并旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地分散在平板中,。

5.將板在37°C孵育過夜。

第3天：

6.用10ml新鮮培養(yǎng)基更換上清液,。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X,，ALSTEM，目錄號(hào)VB100）補(bǔ)充培養(yǎng)基,，以提高病毒滴度,。

7.在37°C孵育24小時(shí)。

第4天（1 ^ST收獲）：

8.將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液收集到50ml無菌帶蓋的錐形離心管中,。

9.在4℃下以3000rpm離心上清液15分鐘以沉淀細(xì)胞碎片,。

10.通過低蛋白結(jié)合0.45-μm無菌過濾器過濾澄清的上清液。

11.病毒已準(zhǔn)備好進(jìn)行感染,，純化,，或者可以在-80°C下作為病毒原液儲(chǔ)存，以備將來使用。等分體積優(yōu)選用于儲(chǔ)存以降低凍融循環(huán)中的病毒滴度損失,。

12.如果需要第二次收獲,，在次收獲后向細(xì)胞中加入10ml*培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)皿放回37℃培養(yǎng)箱中,。

注意：您可以用20μlTiterMax（500X,，ALSTEM，目錄號(hào)VB100）補(bǔ)充培養(yǎng)基,，以提高病毒滴度。

第5天（^第二次收獲）

13.第二次收獲可在第5天完成,，步驟8-11之后,。

14.為了濃縮病毒，將1體積的逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮溶液（ALSTEM,，cat.no.VC200）加入到4體積的病毒上清液中,，并充分混合。

15.將混合物置于4°C冰箱中過夜,，第二天將病毒沉淀,。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱用戶手冊(cè),。

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