Cytoskeleton,，Inc。很高興為藥物篩選,，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品,。我們專注于生產(chǎn)純化蛋白質(zhì)和易于使用的試劑盒，以研究生物化學(xué)和細(xì)胞過(guò)程,。我們的試劑盒可用于少量樣品,，用于基礎(chǔ)研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用于大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）,。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品,，我們還在產(chǎn)品線中為微管，微管蛋白,，運(yùn)動(dòng)蛋白,，小G蛋白效應(yīng)物，GAP,，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務(wù),。

Cytoskeleton的Biochem Kits™是用于分析細(xì)胞骨架生物化學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同方面的綜合試劑盒。這些工具包通常構(gòu)成出版物中圖形的基礎(chǔ),，請(qǐng)查看引文標(biāo)簽中的示例,。該試劑盒附帶了分析所需的所有試劑以及如何使用它們的詳細(xì)說(shuō)明，因此您可以在準(zhǔn)備好試劑盒后立即進(jìn)行分析,！

· 測(cè)量蛋白質(zhì)和藥物對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合/解聚的影響,。

· 發(fā)現(xiàn)和表征肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABPs）,。

· 在細(xì)胞或組織裂解物中定量G-肌動(dòng)蛋白（單體）對(duì)F-肌動(dòng)蛋白（聚合物）。

· 將設(shè)置時(shí)間從幾個(gè)月縮短到幾天,。

許多出版物引用了在論文的材料和方法部分中使用Cytoskeleton的試劑盒,。通常，引文與圖形或圖像形式的特定結(jié)果相關(guān)聯(lián),，這有助于您,，作者,，您的發(fā)現(xiàn),。這表明套件可在短時(shí)間內(nèi)生成出版物質(zhì)量數(shù)據(jù)，從而有助于提高工作效率,。肌動(dòng)蛋白試劑盒的引用示例如下所示,。個(gè)別產(chǎn)品頁(yè)面上提供了更多引文。??

問(wèn)題1：哪種試劑盒是檢測(cè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的*選擇？ 

答案1：  Cytoskeleton有兩個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)分析試劑盒,，是識(shí)別和表征肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的理想選擇,。一個(gè)試劑盒使用肌肉肌動(dòng)蛋白（Cat。＃BK001）,，另一個(gè)試劑盒使用非肌肉肌動(dòng)蛋白（Cat,。＃BK013）。兩種測(cè)定均利用共沉淀來(lái)鑒定蛋白質(zhì)是否與單體或絲狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合以及蛋白質(zhì)是否具有F-肌動(dòng)蛋白切斷或成束特性,。為了檢查與肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合的化合物或蛋白質(zhì),，含有鏈霉抗生物素蛋白包被的孔的96孔板可以與生物素化肌動(dòng)蛋白復(fù)合（Cat。＃AB07）產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白單體捕獲蛋白,。然后可以將化合物,，蛋白質(zhì)或提取物與捕獲蛋白一起溫育，并且可以通過(guò)HRP檢測(cè)系統(tǒng)使用針對(duì)目標(biāo)化合物或蛋白質(zhì)的抗體（或標(biāo)記可以與測(cè)試蛋白綴合）來(lái)顯現(xiàn)結(jié)合,。請(qǐng)記住,，緩沖液組成也很重要，因?yàn)樗枰望}（約50 mM）并含有CaCl 2（或其他二價(jià)陽(yáng)離子）和ATP以維持肌動(dòng)蛋白單體的穩(wěn)定性,。有關(guān)兼容緩沖液的示例,，請(qǐng)參閱我們的一般肌動(dòng)蛋白緩沖液配方（Cat。＃BSA01-001）,?；蛘?，可以用GST標(biāo)記感興趣的蛋白質(zhì)（避免還原劑）并與板綴合，然后與生物素化的肌動(dòng)蛋白一起溫育,，并用HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白顯現(xiàn),。

問(wèn)題2：當(dāng)我對(duì)感興趣的肌動(dòng)蛋白沒(méi)有可用的芘結(jié)合物（例如心臟，平滑肌或細(xì)胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白）時(shí),，如何用芘測(cè)定法測(cè)量肌動(dòng)蛋白聚合,？ 

答案2：  為了檢查未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白的聚合，請(qǐng)點(diǎn)擊此處查看使用過(guò)量未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（心肌,，平滑肌或細(xì)胞質(zhì)）加10％芘標(biāo)記肌肉肌動(dòng)蛋白的聚合方案,。芘肌肉肌動(dòng)蛋白不會(huì)以該測(cè)定中使用的濃度自身聚合，因此反應(yīng)依賴于未標(biāo)記的非肌肉肌動(dòng)蛋白形成F-肌動(dòng)蛋白,。以這種方式,，芘標(biāo)記的肌肉肌動(dòng)蛋白被吸收并聚合以充當(dāng)用于聚合未標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白的報(bào)道分子，其以更高的濃度存在,。

問(wèn)題3：如何從細(xì)胞或組織提取物中測(cè)量G-和F-肌動(dòng)蛋白,？ 

答案3：  確定細(xì)胞或組織樣本中游離球狀肌動(dòng)蛋白（G-肌動(dòng)蛋白）含量與絲狀肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）含量的可重復(fù)和準(zhǔn)確的方法是使用F-肌動(dòng)蛋白和G-肌動(dòng)蛋白部分的Western印跡定量。 ,。一般方法是使F-肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定緩沖液中的細(xì)胞或組織均質(zhì)化,，然后高速離心以將F-肌動(dòng)蛋白與G-肌動(dòng)蛋白池分離。然后通過(guò)SDS-PAGE分離級(jí)分,，并通過(guò)Western印跡定量肌動(dòng)蛋白,。終結(jié)果給出了準(zhǔn)確的方法來(lái)確定摻入細(xì)胞骨架的F-肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的G-肌動(dòng)蛋白的比例。細(xì)胞骨架提供了一種簡(jiǎn)單易用的選擇,，可用G-肌動(dòng)蛋白/ F-肌動(dòng)蛋白體內(nèi)檢測(cè)試劑盒（Cat,。＃BK037）定量G-和F-肌動(dòng)蛋白。該試劑盒提供了在不同處理?xiàng)l件下定量細(xì)胞或組織樣品中單體和聚合肌動(dòng)蛋白水平的所有必需試劑,。將樣品離心,，然后將沉淀（F-肌動(dòng)蛋白）和上清液（G-肌動(dòng)蛋白）溶解于SDS上樣緩沖液中并通過(guò)Western印跡處理。 

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肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)分析Biochem試劑盒：人血小板肌動(dòng)蛋白

窗體頂端

30-100次分析（Cat,。＃BK013）

窗體底端

產(chǎn)品用途包括

· 確定蛋白質(zhì)是否與肌動(dòng)蛋白的細(xì)絲或單體結(jié)合,。

· 確定蛋白質(zhì)是否捆綁F-肌動(dòng)蛋白

· 測(cè)試與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的各種條件（例如適pH）或要求（例如二價(jià)陽(yáng)離子要求）

簡(jiǎn)介
肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白降速測(cè)定試劑盒提供G-或F-肌動(dòng)蛋白加陽(yáng)性（α - 肌動(dòng)蛋白）和陰性（牛血清白蛋白，BSA）結(jié)合對(duì)照蛋白,。肌動(dòng)蛋白結(jié)合發(fā)生在對(duì)肌動(dòng)蛋白的任何部位具有親和力時(shí),。可以通過(guò)使用降速法測(cè)量F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合,。以這種方式,，離心用于通過(guò)差異沉降將F-肌動(dòng)蛋白與G-肌動(dòng)蛋白分離。F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白將與肌動(dòng)蛋白絲共沉淀并在離心管底部形成沉淀,?？梢詸z測(cè)具有F-肌動(dòng)蛋白成束活性的蛋白質(zhì),，因?yàn)樗鼈儗?dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白以比正常更低的離心力沉降（14,000xg對(duì)150,000xg）,。F-肌動(dòng)蛋白切斷蛋白,，G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白或非肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白將留在上清液中。如果上清液中殘留的G-肌動(dòng)蛋白比陰性對(duì)照樣品中的G-肌動(dòng)蛋白更多,，則可以預(yù)期切斷蛋白質(zhì),，并且應(yīng)該通過(guò)在添加測(cè)試蛋白質(zhì)之前和之后測(cè)量F-肌動(dòng)蛋白長(zhǎng)度分布來(lái)進(jìn)一步測(cè)試該活性。G-肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白可以通過(guò)將測(cè)試蛋白添加到G-肌動(dòng)蛋白并誘導(dǎo)聚合來(lái)測(cè)量,，如果測(cè)試蛋白螯合G-肌動(dòng)蛋白,，那么在旋轉(zhuǎn)測(cè)定期間，與對(duì)照相比,，肌動(dòng)蛋白將留在上清液中,。

肌動(dòng)蛋白可以以兩種形式存在：球狀亞單位（G-肌動(dòng)蛋白）和絲狀聚合物（F-肌動(dòng)蛋白）（有關(guān)更多信息，請(qǐng)參見(jiàn)關(guān)于肌動(dòng)蛋白頁(yè)面）,。兩種形式的肌動(dòng)蛋白都與細(xì)胞中過(guò)多的蛋白質(zhì)相互作用,。到目前為止，有超過(guò)50種不同類別的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP）,，而且?guī)齑嫒赃h(yuǎn)未完成,。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白允許肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架快速響應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞外信號(hào)，并且在許多細(xì)胞過(guò)程中對(duì)細(xì)胞骨架參與是*的,。這些包括細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng),，肌肉收縮，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,，細(xì)胞發(fā)病機(jī)理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),。

該試劑盒含有非肌肉肌動(dòng)蛋白（Cat。＃APHL99）,。同樣的試劑盒也可用于骨骼肌肌動(dòng)蛋白（Cat,。＃AKL99），參見(jiàn)Cat,。＃BK001,。骨骼肌肌動(dòng)蛋白旋轉(zhuǎn)試劑盒可能更適合用于研究來(lái)自肌肉組織的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。

試劑盒內(nèi)容
該試劑盒包含足夠的材料,，可根據(jù)檢測(cè)體積進(jìn)行30-100次檢測(cè),。包括以下試劑：

00001. 8 x250μg非肌肉肌動(dòng)蛋白（Cat。＃APHL99）,。

00002. α- Actinin,，陽(yáng)性對(duì)照（Cat。＃AT01）,。

00003. BSA,，陰性對(duì)照

00004. 一般肌動(dòng)蛋白緩沖液（Cat,。＃BSA01）。

00005. 肌動(dòng)蛋白聚合緩沖液（Cat,。＃BSA02）

00006. F-肌動(dòng)蛋白緩沖液,。

00007. ATP，100 mM（Cat,。＃BSA04）

00008. EGTA,，0.5米

00009. 的MgCl ₂，100毫

00010. Tris-HCl pH 6.5,1.0M

00011. Tris-HCl pH 7.5,100mM

00012. 手冊(cè)詳細(xì)的協(xié)議和廣泛的故障排除指南

需要的設(shè)備

00001. 離心設(shè)置能夠在4°C和24°C下容量為150,000 xg,，體積容量為50-200μl,。

00002. SDS-PAGE系統(tǒng)。

00003. 感興趣的蛋白質(zhì)的檢測(cè)系統(tǒng)（考馬斯有利于純化的蛋白質(zhì),，蛋白質(zhì)印跡或銀染色用于較低純度或低豐度的測(cè)試蛋白質(zhì)）,。

00004. 用于光密度測(cè)定的凝膠掃描儀。

問(wèn)題1：當(dāng)使用非肌肉肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat,。＃BK013或肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒Cat,。＃BK001）時(shí)，制備肌動(dòng)蛋白結(jié)合試驗(yàn)蛋白的*條件是什么,？

答案1：  在肌動(dòng)蛋白相容緩沖液（如HEPES或磷酸鹽緩沖液）中使測(cè)試蛋白質(zhì)達(dá)到盡可能高的濃度,。高濃度（優(yōu)選>20μM）是優(yōu)化檢測(cè)肌動(dòng)蛋白和測(cè)試蛋白之間相互作用的機(jī)會(huì)所必需的。在某些情況下,，K _d肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白/肌動(dòng)蛋白相互作用的（解離常數(shù)）可以低到不能通過(guò)顆粒的蛋白質(zhì)測(cè)定檢測(cè)到; 然而,，對(duì)于肌動(dòng)蛋白在反應(yīng)混合物中的影響可能足以通過(guò)沉淀和上清液中的肌動(dòng)蛋白量與陰性對(duì)照的差異來(lái)檢測(cè)。我們還建議將測(cè)試蛋白質(zhì)在150,000 xg下在4°C下離心1小時(shí),，以去除變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片,。如果已經(jīng)采取其他步驟（例如親和柱純化）來(lái)純化測(cè)試蛋白，則這不是必需的,。高速離心后,，取出上清液置于冰上。這是測(cè)試蛋白質(zhì)原料,。

總離子強(qiáng)度應(yīng)低于50 mM,，這是由于肌動(dòng)蛋白結(jié)合的特性，因此它主要是離子的,，因此會(huì)受到中鹽和高鹽緩沖液的影響,。一個(gè)好的起始緩沖液是20 mM Hepes pH 7.4加20 mM KCl，加上蛋白酶抑制劑,，磷酸酶抑制劑和任何必要的輔助因子,。可以用20mM MgCl ₂和10mM ATP 制備低鹽肌動(dòng)蛋白聚合10x緩沖液，從而使鹽在終反應(yīng)中保持低水平,。 

需要考慮的其他問(wèn)題是（i）測(cè)試蛋白輔助因子可能是必需的,，（ii）測(cè)定中的因子可能是主動(dòng)抑制相互作用，（iii）測(cè)試蛋白可能偏愛(ài)不同類型的肌動(dòng)蛋白,，或（ iv）測(cè)試蛋白質(zhì)在組織提取物中可以是低濃度的,。

為了解決這些潛在問(wèn)題中的一些，可以添加試劑以去除抑制劑,，例如用于鈣的EGTA（部件號(hào)BSEG-01）,。在運(yùn)動(dòng)蛋白的情況下，ATP / Mg2 +組合將使運(yùn)動(dòng)與F-肌動(dòng)蛋白解離,，因此以1mM使用不可水解的類似物如AMPPNP。肌動(dòng)蛋白親和柱可用于濃縮和分離更多的測(cè)試蛋白,。后,，不同的pH條件可以改善肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白之間的結(jié)合（例如，α-輔肌動(dòng)蛋白的適pH為7.0）,。

問(wèn)題2：非肌肉肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat,。＃BK013）可用于測(cè)定非肌肉肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白之間的結(jié)合親和力嗎？

答案2：   結(jié)合親和力（K _d）可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)降低測(cè)定來(lái)估計(jì),，通過(guò)滴定測(cè)試蛋白質(zhì)濃度在0.2和20μM之間,，并找到原始蛋白質(zhì)在顆粒中的一半的濃度。繪制百分比測(cè)試蛋白質(zhì)結(jié)合對(duì)比反應(yīng)中的原始濃度以獲得以μM計(jì)的Kd,。

問(wèn)題3：細(xì)胞裂解液可以與非肌肉肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白生物化學(xué)試劑盒（Cat,。＃BK013）一起用作測(cè)試蛋白的來(lái)源嗎？

答案3：是的,，細(xì)胞裂解液可用作測(cè)試蛋白的來(lái)源,。然而，細(xì)胞骨架不建議這樣做,，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的純度和濃度通常太低而不能與肌動(dòng)蛋白相互作用,。此外，裂解物將含有額外的輔助蛋白和多種磷酸酶和蛋白酶,，它們可以干擾或改變肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白之間的相互作用,。如果要使用裂解物，我們建議如下：

盡管該試劑盒設(shè)計(jì)用于純蛋白質(zhì)或化合物,，但一些研究人員已經(jīng)添加了具有良好結(jié)果的提取物,。通常研究人員使用過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)和類似過(guò)表達(dá)的野生型對(duì)照提取物。需要制備10mg / ml蛋白質(zhì)提取物,，然后將其1/3體積用于1mg / ml的2/3體積的肌動(dòng)蛋白,。以這種方式，存在足夠高的蛋白質(zhì)濃度以指示結(jié)合。提取緩沖液應(yīng)為20mM Hepes緩沖液pH 7.4,20mM NaCl,，加上蛋白質(zhì)的任何輔因子,，以及蛋白酶抑制劑混合物如Cat。＃PIC02,。也可加入磷酸酶抑制劑,。用冰冷的緩沖液沖洗細(xì)胞，用注射器針頭或其他裝置彎曲25g裂解細(xì)胞,。pH可以將肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABP）的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合特性改變0至100％,。對(duì)于提取物制備，測(cè)試pH 6.5,7.5和8.5是個(gè)好主意,。對(duì)照細(xì)胞系非常關(guān)鍵,，因?yàn)闈撛诘腁BP可能通過(guò)其他途徑出現(xiàn)在顆粒中; 例如，變性或與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)聚集,?？傠x子強(qiáng)度應(yīng)保持在50 mM以下，以免使任何潛在的ABP脫鹽,。

抗體

· 概述

· 常見(jiàn)問(wèn)題解答

Cytoskeleton Inc致力于為肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白提供高質(zhì)量的抗體,。我們?cè)谠撓盗挟a(chǎn)品中的所有抗體均經(jīng)過(guò)QC Max™測(cè)試。已經(jīng)測(cè)試QC Max TM抗體用于蛋白質(zhì)印跡,，原位和免疫沉淀,。這樣，您就可以準(zhǔn)確了解每種抗體的用途,，并確保購(gòu)買適合您的抗體,。如果您對(duì)我們的QC Max™抗體有關(guān)的詳細(xì)信息，請(qǐng)點(diǎn)擊下面列出的產(chǎn)品以獲取更多詳細(xì)信息,。

問(wèn)題1：在細(xì)胞和組織中染色F-肌動(dòng)蛋白的*方法是什么,？

答案2：   細(xì)胞骨架提供我們的Acti染色系列熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，可在固定細(xì)胞和組織樣本中特異性染色F-肌動(dòng)蛋白,。Acti染色熒光鬼筆環(huán)肽探針?lè)浅Ｃ髁梁头€(wěn)定,，為標(biāo)記F-肌動(dòng)蛋白提供了一種非常簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的方法。鬼筆環(huán)肽用不同的綠色和紅色熒光團(tuán)（Cat,。＃PHDG1,，PHDR1，PHDH1和PHDN1）標(biāo)記,。也可以使用肌動(dòng)蛋白抗體,，但通常那些也染色G-肌動(dòng)蛋白，這產(chǎn)生高背景,。

問(wèn)題2：您對(duì)多克隆抗肌動(dòng)蛋白抗體有何推薦稀釋度,？

答案2：   抗體的稀釋度取決于所使用的細(xì)胞/組織類型和實(shí)驗(yàn)形式。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，我們已經(jīng)測(cè)試并推薦使用濃度為500ng / ml（1：1000稀釋）的抗體,。在該稀釋度下,，我們?cè)诜侵拮?nbsp;A6細(xì)胞，小鼠Swiss 3T3細(xì)胞,，大鼠NRK細(xì)胞,，人HeLa細(xì)胞和血小板細(xì)胞的細(xì)胞提取物中檢測(cè)到肌動(dòng)蛋白。對(duì)于免疫熒光,，我們使用抗肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)小鼠Swiss 3T3細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白,。抗體以2μg/ ml（1：500稀釋）的濃度使用,，然后與1：500稀釋的抗兔羅丹明綴合的第二抗體一起溫育,。這些信息通常在圖例中或我們的抗體數(shù)據(jù)表的“產(chǎn)品用途”部分中找到。

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