材料加工實驗方案：


1. 培養(yǎng)孔包被程序： 使用這些建議作為指導來確定適合您的培養(yǎng)系統(tǒng)的最佳包被條件,。

  1. 從瓶子中取出所需數(shù)量的絲溶液并分配到稀釋容器中,。

  2. 用水稀釋絲溶液至 1 mg/mL (1:50)。

  3. 輕輕旋轉(zhuǎn)內(nèi)容物,，直到材料*混合,。

  4. 在培養(yǎng)表面加入適量的稀釋絲溶液，確保整個表面都被涂層,。

  5. 在無蓋的室溫下在干凈的工作臺 (ISO 100) 中孵育 2-3 小時以*干燥,。

  6. 孵化后應(yīng)用 70% 甲醇 20 分鐘以誘導不溶于水的絲綢表面。

  7. 用無菌培養(yǎng)基或 PBS 仔細沖洗涂層表面,。不要刮傷表面,。

  8. 涂層表面可供使用或可在 4°C 下儲存以備將來使用。

2. 濃縮絲溶液： 如果需要更高的絲濃度,，則使用此技術(shù),。更高的絲濃度對于特定的加工技術(shù)或修改最終材料特性可能很重要。

  1. 準備 10% (W/V),。聚乙二醇 (PEG, 10K MW) 與去離子水的溶液,。與磁性攪拌板上的大攪拌棒混合，直到 PEG *溶解,。

  2. 獲得分子量截止在 3,500 和 10,000 Da 之間的透析膜,。如有必要，按照制造商的要求對透析盒進行水合,。

  3. 根據(jù)透析膜制造商的填充量指南，用適量的 5% 絲溶液填充透析膜,。

  4. 將填充絲溶液的透析膜放入 10%（重量/體積）PEG 溶液中并蓋上,。

  5. 指明盒式磁帶添加到溶液中的時間和日期,。典型的濃縮時間將根據(jù)所需的絲溶液最終濃度、被濃縮的絲溶液的體積和使用的透析膜而變化,。
    注意 作為典型示例,，10 mL 的 5% 蠶絲溶液在 10% (W/V) PEG 透析 20-22 小時后將產(chǎn)生 2-4 mL 濃縮蠶絲溶液。通常,，通常根據(jù)用戶要求推薦優(yōu)化運行,。

  6. 濃縮時間結(jié)束后，從 PEG 浴和透析盒中取出濃縮的絲溶液,，并將絲溶液儲存在 4°C 以備將來使用,。注意：絲綢溶液的保質(zhì)期隨著濃度的增加而縮短，因此在生產(chǎn)后 1 周內(nèi)盡快使用濃縮的絲綢溶液,。

  7. 蠶絲溶液濃度可以通過重量百分比濃度來確定,。為此，請在精密天平上稱出大約 100 μL 的濃縮絲溶液并記錄濕重,。讓溶液干燥成薄膜并測量絲蛋白干重,。將干重除以濕重并乘以 100% 得到溶液的重量百分比濃度。

3. 獨立式絲膜： 這種加工方法生產(chǎn)的獨立式絲膜材料可用于細胞培養(yǎng)或體內(nèi)移植,。獨立式絲膜具有易于從培養(yǎng)條件中移除以進行進一步樣品分析的優(yōu)勢,。

  1. 將 7 mL 的 5% 絲溶液添加到 100 mm 培養(yǎng)皿中，并允許在干凈的工作臺環(huán)境中裸露干燥,。這通常需要幾個小時,，最好過夜。

  2. 形成的薄膜厚度約為 40-60 µm,，可以使用鑷子從培養(yǎng)皿中取出,。增加蠶絲溶液的量或使用更高濃度的蠶絲溶液會產(chǎn)生更厚的薄膜。

  3. 這些薄膜目前是水溶性的,，可以使用以下任一方法使其不溶于細胞培養(yǎng)：

一世,。甲醇浴培養(yǎng)：
a．用 70% 甲醇和 30% 去離子水填充盤子并混合。
灣,。將絲膜放入甲醇溶液中 10 分鐘,。
C。去除絲膜并用無菌水或適當?shù)慕橘|(zhì)沖洗,。
    注意： 這種處理方法可以快速產(chǎn)生不溶性絲膜材料特性,，這些特性往往是不透明的、更疏水的,，并且原位降解速度慢,。

ii. 水退火：
a．獲得一個清空的實驗室真空干燥器，并在底部部分填充水,。
灣,。將薄膜放在水面上方的架子上,，蓋上蓋子，然后拉 25 in Hg 真空,。
C,。停止公雞室，并允許坐 4 小時,。
d,。從腔室中取出樣品并用 70% 乙醇消毒，然后用無菌水或適當?shù)慕橘|(zhì)沖洗,。
   注意：這種加工方法產(chǎn)生的不溶性絲膜材料特性往往是透明的,，更親水，并且在原位降解速度快,。

  1. 如果不立即使用,，可以將薄膜切割成型并在室溫下儲存 2 年或更長時間。
    注意： 絲膜也可以澆鑄到帶圖案的表面上以復制表面形貌,，通常使用硅橡膠或類似材料來輕松去除絲材料,。此外，由于潛在的材料浮力,，可能需要使用加權(quán)方法來保持薄膜浸沒在介質(zhì)中,。

4.  3D Silk Sponge Scaffolds： 這種處理方法為體外和體內(nèi)應(yīng)用或原位植入創(chuàng)建 3D 多孔支架。支架孔徑和可降解特性也可以使用以下方法進行調(diào)整,。

A. 將蠶絲溶液等分到所需的成型容器中,，建議使用聚四氟乙烯，以便于去除材料,。

B. 對于每個正在制備的樣品,，稱量必要量的鹽，以保持鹽與絲的重量比為 25:1,。
注意：對孔徑的控制取決于所選的氯化鈉（鹽）晶體尺寸,。如果確定的孔徑大小，請使用不銹鋼篩網(wǎng)以產(chǎn)生均勻的鹽晶體大小,。對于 750 µm 及更大的鹽顆粒,，建議將蠶絲溶液濃縮至 8% 或以上。

C. 在旋轉(zhuǎn)模具的同時將鹽緩慢添加到蠶絲溶液中,，以使鹽添加均勻,。確保通過輕微攪拌或敲擊表面小心去除因材料移位而形成的氣泡。

D. 蓋上模具,，讓溶液在室溫下靜置 1-2 天,，以形成絲質(zhì)支架。

E. 支架形成后，取下模具蓋,，將樣品放入 2 升 DI 燒杯中,，然后放在攪拌板上。

F. 48小時內(nèi)每8-12小時換一次水,。

H. 洗滌期結(jié)束后，從模具中取出形成的支架并放入最后的去離子水中沖洗 24 小時,，以確保*去除殘留的鹽分,。

I. 支架可在去離子水中 4 °C 儲存或在室溫下干燥直至需要。

J. 腳手架可切割成所需尺寸并在使用前進行蒸汽滅菌

5. 3D Silk Hydrogels： 這種加工方法可用于生產(chǎn)絲水凝膠,，用作可注射生物材料,、體外培養(yǎng)和體內(nèi)使用。

A. 將 5% 的絲溶液放入所需的成型容器或小瓶中,。

B. 用膠帶將容器或小瓶垂直固定到實驗室渦旋儀上,。

C. 以最大轉(zhuǎn)速渦旋溶液幾分鐘。這些參數(shù)需要針對給定的絲溶液體積和模具幾何形狀進行優(yōu)化,。

注意：例如,，將 1 mL 的絲溶液移液到玻璃小瓶中，并在 3,200 RPM 下渦旋約 7 分鐘,。溶液應(yīng)增加濁度,，表明膠凝過程已開始。

注意：一旦溶液被渦旋,，在凝膠化完成之前不要將溶液轉(zhuǎn)移到第二個容器中,。

D. 將渦旋絲/成型容器/小瓶置于 37 °C 培養(yǎng)箱中過夜，以加快凝膠時間,。

E. 絲水凝膠只要保持水分并儲存在 4°C 的去離子水中,，就可以用于未來使用。