chondrex膠原酶簡介

Cat# 5002 - 重組人 MMP-13（截斷型） - 處于缺貨狀態(tài),，直至未來通知,。給您帶來的不便,，我們深表歉意。

膠原酶是基質金屬蛋白酶 (MMP) 家族的成員,，這是一組參與細胞外基質 (ECM) 和結締組織的生理和病理更新的蛋白酶,。MMP 可以根據(jù)其報告的底物特異性（膠原酶、明膠酶,、溶基質素）和結構（膜型 MMP）進行分組,。膠原酶（MMP-1、MMP-8,、MMP-13）可以特異性降解天然纖維狀膠原蛋白（I,、II、III,、VII 和 X 型）在其定型三螺旋結構域中,，以及變性膠原蛋白（明膠）。然而,，底物特異性因膠原酶而異,。膠原酶在健康組織中的表達通常較低,，但在炎癥條件、惡性組織和其他產生促炎細胞因子環(huán)境的病理條件下會升高,。因此,，膠原酶是影響軟骨組織的疾病的有趣治療靶點。

為了研究蛋白酶對天然 I 型膠原蛋白和 II 型膠原蛋白底物的活性,，Chondrex, Inc. 提供了快速膠原酶活性測定試劑盒以及 細菌膠原酶活性測定試劑盒,。通過使用天然形式的膠原蛋白作為底物，這些測定可以排除其他 MMP 的酶活性,，因為只有膠原酶可以切割天然形式的纖維狀膠原蛋白,。此外，MMP-13 Inhibitor Activity Assay Kit適用于評估 MMP-13 抑制劑的功效,。 

Chondrex, Inc. 還提供全長潛伏型重組人 MMP-8（貨號 5001）以及截短的重組人 MMP-13（貨號 5002）,，它們是使用 I 型膠原蛋白進行膠原酶活性測定的理想?yún)⒖?Cat# 4001) 和 II 型膠原蛋白 (Cat# 4002) 底物。

膠原酶檢測試劑盒

膠原酶底物

膠原酶 (MMP)

快速膠原酶活性測定試劑盒

膠原酶活性快速檢測試劑盒利用重組人中性粒細胞前膠原酶 (MMP-8) 作為參考膠原酶,，以及兩種類型的膠原酶激活劑（APMA 和胰蛋白酶）。Cat#3001 使用 FITC 標記的牛 I 型膠原蛋白,，而 Cat#3002 使用 FITC 標記的 II 型膠原蛋白作為膠原酶底物,。使用這些熒光底物可以實現(xiàn)比傳統(tǒng)底物凝膠分析快 10 倍的反應和更短的工作時間（約 2 小時）。每個歸類為膠原酶的 MMP 都可以切割天然形式的纖維狀膠原蛋白,。然而,，它們對膠原蛋白類型的親和力不同：MMP-1 更容易降解 III 型膠原蛋白，MMP-8 更容易降解 I 型膠原蛋白,，而 MMP-13 優(yōu)先降解 II 型膠原蛋白,。鑒于這些差異，在選擇 MMP 活性檢測方法時,，重要的是要考慮 MMP 的底物特異性,。

下面的圖 1提供了有關這些試劑盒中使用的檢測系統(tǒng)的更多信息。膠原酶會在 N 端切割膠原蛋白,。 

這些 FITC 膠原底物以及參考 MMP 酶可單獨購買,。

圖1?？焖倌z原酶活性測定試劑盒程序的一般概述,。有關更多信息，請參閱試劑盒協(xié)議,。 

激活參考 MMP* 和樣品 MMP 是該檢測中最關鍵的步驟之一,。APMA 是潛伏膠原酶的通用激活劑。然而,，樣品中可能含有膠原酶抑制劑（例如 α 2 巨球蛋白,、TIMPs）,，可以阻止 APMA 的反向激活。因此,，對于這些樣品,，胰蛋白酶也被用作活化劑。有關膠原酶活性測定樣品制備的更多信息,，請聯(lián)系我們,。 

細菌膠原酶活性檢測試劑盒

我們對細菌膠原酶的了解大部分來自使用從溶血梭菌中發(fā)現(xiàn)的（細菌或哺乳動物來源的）第一種膠原酶的實驗. 基于這些研究，細菌膠原酶根據(jù)其反應性分為兩類,。I類膠原酶對膠原蛋白活性強,，對合成分子活性弱。II 類膠原酶與合成肽反應強烈,，但與膠原蛋白反應較弱,。然而，自從進行這些分類以來,，已經鑒定了幾種其他類型的細菌膠原酶,。在病理學上，細菌膠原酶是許多病原菌的重要毒力因子,，主要負責降解宿主 ECM 并為細菌生長和增殖提供生態(tài)位 (1),。有趣的是，溶組織梭菌膠原酶已用于治療 Dupuytren 病和佩羅尼病 (2,3) 患者,。

細菌膠原酶活性測定試劑盒利用溶組織梭菌膠原酶作為參照,，并使用 FITC 標記的可溶性牛 I 型膠原底物。與基質凝膠分析和基于放射性標記的膠原蛋白的分析相比,，該分析系統(tǒng)提供了更快的反應時間和更高的靈敏度,。使用該試劑盒可以運行大約 100 個膠原酶活性測定和/或膠原酶抑制劑測定樣品。
該試劑盒類似于用于哺乳動物 MMP（膠原酶）的快速膠原酶活性檢測試劑盒,，但有幾個主要區(qū)別,。與哺乳動物 MMP 不同,，細菌膠原酶會將膠原蛋白*降解為變性的肽片段,。因此，彈性蛋白酶消化對于該測定是必要的,。此外,，細菌檢測通常已經以其活性形式存在，因此不需要激活步驟,。 
細菌膠原酶活性檢測試劑盒是檢測 I 類膠原酶活性以及評估 I 類膠原酶抑制劑的理想選擇,。有關不同協(xié)議的更多信息，請參閱試劑盒協(xié)議,。 

酶活性的計算

膠原酶活性試劑盒包括參考膠原酶,，但是樣品中的酶活性不能像在 ELISA 中那樣使用標準曲線計算,。相反，膠原酶活性必須計算為單位/分鐘/毫升,，以便在標準和樣品之間進行適當?shù)谋容^（圖 2）,。

圖2。MMP-8 活性曲線示例,。A) 使用 FITC I 型膠原蛋白作為底物的 MMP-8 活性劑量反應 - 不同量（2.5 – 10 µl）的參考 MMP-8（100 單位/毫升）在 35 ℃與 100 µg FITC I 型膠原蛋白反應°C 60 分鐘,。加入 10 µl Enhancer 后，將混合物在 35°C 下進一步孵育 10 分鐘,。B)使用 FITC-I 型膠原蛋白作為基質的 MMP-8 活性時間 - 2.5 ml MMP-8（100 單位/ml）與 100 µg FITC-I 型膠原蛋白在 35°C 下反應 90 分鐘,。

1 單位的膠原蛋白溶解活性定義為每分鐘裂解 1 µg 膠原蛋白（1 膠原蛋白溶解單位 = 1 µg/分鐘）。由于該試劑盒使用 100 µg 膠原蛋白作為底物,，因此可以使用以下公式計算溶膠原活性：

圖3,。在 Chondrex, Inc. 的膠原酶活性測定試劑盒中計算溶膠原活性的方程式。FI sample :樣品的熒光強度,；FI空白: 空白 FI控制的熒光強度 : 控制的熒光強度

該試劑盒的檢測靈敏度受反應（孵育）時間的影響很大,。更長的孵育時間會增加檢測的靈敏度。然而,，由于其他蛋白酶降解或變性膠原蛋白片段,，過度孵育會增加背景信號。此外,，反應時間不足（10 分鐘或更短）可能會影響檢測的重現(xiàn)性,。推薦的孵育時間為一小時；但是,，必須針對您的樣品優(yōu)化反應時間,。測定靈敏度可以通過比較樣品的熒光強度 (FI) 和空白的 FI 來確定。為了獲得準確的測定結果,，樣品的 FI 應至少比空白的 FI 高 1.5 倍,。例如，如果空白 FI 為 1000,，則樣品 FI 必須高于 1500 才能獲得準確的測定結果,。  

測定溫度也會影響測定靈敏度。一旦膠原蛋白熱變性（天然膠原蛋白為 40°C,，膠原酶裂解的膠原蛋白為 35°C）,，由于彈性蛋白酶消化變性膠原蛋白，樣品結果可能被高估,。此外,，在選擇底物時，膠原底物的酶特異性是一個重要的考慮因素,。 

FITC 標記的 I 型和 II 型膠原蛋白

FITC 標記的牛 I 型和II 型膠原蛋白（以 1:1 的比例結合）是檢查膠原酶活性的底物,。為了最大限度地減少 MMP（膠原酶）測定中的背景值,，這些標記的底物已制備為不含端肽。此外,，非特異性結合膠原蛋白的 FITC 已通過離子交換色譜法去除,。

FITC 標記的膠原蛋白也可用于為原代細胞培養(yǎng)創(chuàng)建支架或建立細胞培養(yǎng)。如果以這種方式使用,，則可以通過測量培養(yǎng)物上清液中降解的 FITC 膠原蛋白的 FI（520 nm 發(fā)射/490 nm 激發(fā)）來確定細胞的膠原酶活性,。然而，培養(yǎng)基中存在的蛋白質和染料可能會導致 FI 猝滅,。優(yōu)化檢測和培養(yǎng)條件有助于確保一致和可靠的結果,。

出于這個原因，Chondrex, Inc. 建議在創(chuàng)建細胞培養(yǎng)支架時使用高濃度的 FITC 膠原蛋白,。請與我們聯(lián)系以獲取更多信息,。  

Chondrex, Inc. 還提供許多其他等級的純化膠原蛋白，用于各種實驗目的,。 

MMP-13 抑制劑檢測試劑盒

MMP-13（膠原酶 3）是一種最初在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的基質金屬蛋白酶 (4),。隨后，MMP mRNA 分析顯示骨關節(jié)炎 (OA) 軟骨細胞 (5-7) 以及多種惡性腫瘤類型 (8) 中 MMP-13 的表達水平增加,。在生理上,，MMP-13 主要在胚胎發(fā)育 (9,10) 和傷口愈合 (11,12) 期間發(fā)揮作用。已觀察到軟骨細胞和滑膜細胞中 MMP-13 的產生被炎癥介質如白細胞介素 17 (IL-17),、IL-1,、腫瘤壞死因子 α (TNF-α)和制瘤素 M (13- 15)。天然存在的金屬蛋白酶組織抑制劑 (TIMP) 在 MMP 活性的調節(jié)中也起著關鍵作用 (16),。

鑒于 MMP-13 傾向于降解 II 型膠原蛋白,，它與類風濕性關節(jié)炎 (RA) 和 OA 中的軟骨破壞有關。因此,，幾種 MMP-13 抑制劑已在小鼠膠原誘導的關節(jié)炎模型中作為治療化合物進行了測試 (17),。事實上，已經開發(fā)并廣泛研究了幾種人為的 MMP 抑制劑（主要是鋅螯合劑,，如 batimastat 和 marimastat,，它們可阻斷 MMP 的催化位點）作為多種疾病的治療劑。然而,，由于嚴重和全身性的副作用,，它們在臨床試驗中都失敗了 (18),。最近,，新類別的更具選擇性的 MMP 抑制劑（例如基于單克隆抗體的抑制劑和工程蛋白）作為癌癥和 OA 的治療選擇引起了人們的興趣。 

Chondrex, Inc. 的MMP-13 Inhibitor Assay Kit 提供了一種簡單的方法來篩選和評估實驗性 MMP-13 和其他 MMP 抑制劑的功效,。使用截短的重組人 MMP-13 (rhMMP13) 和蛋白酶抑制劑作為參考,，您可以監(jiān)測合成熒光肽底物*的裂解,。只需使用任何感興趣的實驗抑制劑化合物代替試劑盒提供的蛋白酶抑制劑（目錄號 30046）來評估化合物的抑制潛力。 

*底物不含膠原三螺旋,，因此對非膠原蛋白水解蛋白酶敏感,。

圖 4 - 產生膠原酶的樹突細胞：  由含有 IL-1 的中性粒細胞提取物刺激的大鼠滑膜細胞觸發(fā)成纖維細胞向樹突細胞的形態(tài)變化。

重組人 MMP-8（膠原酶 2）

MMP-8（也稱為中性粒細胞彈性蛋白酶）是一種由活化的中性粒細胞釋放的膠原酶,，可優(yōu)先降解 I 型膠原蛋白,。MMP-8 蛋白水解活性被 TIMP-1 和 TIMP-2 抑制。與許多其他 MMP 不同,，MMP-8 的功能似乎可以抑制腫瘤轉移 (19,20) 以及實驗性關節(jié)炎模型 (21),。在分析生理和病理條件下的 MMP 動態(tài)時，Chondrex, Inc. 的重組人 MMP-8是一種有用的參考膠原酶,。 

在測定膠原酶活性或評估 MMP/膠原酶抑制劑（如 TIMPS）時,，最關鍵的步驟之一是激活潛在的膠原酶。Chondrex, Inc. 的重組人 MMP-8 是一種全長,、潛伏的膠原酶,，可用于此目的。此外,，Cat# 3001 可以使用 APMA 激活,，因此也可用于評估 MMP（膠原酶）抑制劑。 

重組人 MMP-13（膠原酶 3）,，截短

MMP-13 具有多種生理作用（骨代謝,、傷口愈合）以及多種病理狀況（腫瘤侵襲和轉移 (22)、骨關節(jié)炎 (23)）,。重組人膠原酶原 MMP-13的活性形式（從 C 端截斷）可用于通過使用熒光合成肽作為底物來研究抑制劑,。然而，重要的是要注意這種截短形式的 MMP-13 不能消化天然膠原蛋白,，因為它不包含膠原蛋白結合基序,。

胰蛋白酶活性測定試劑盒

胰蛋白酶由胰腺產生，在促進小腸中的蛋白質消化和營養(yǎng)吸收方面起著關鍵作用,。它還通過控制腸腔中的殺微生物劑濃度和維持上皮屏障的完整性來幫助調節(jié)胃腸道免疫反應 (24,25),。由于這些功能，胰蛋白酶被廣泛用于蛋白質或肽相關研究,，以合成和測序肽,、維持培養(yǎng)的細胞和消化蛋白質 (26)。 

Chondrex, Inc. 提供了一種顯色胰蛋白酶活性測定試劑盒,，它使用 Boc-Gln-Ala-Arg-pNA 底物在短短 15 分鐘內測量胰蛋白酶樣酶活性,。胰蛋白酶裂解底物 Arg 中的羰基，釋放出對硝基苯胺 (pNA)，產生黃色并可使用光密度進行量化 (27),。該試劑盒適用于胰蛋白酶和任何裂解底物的蛋白酶/肽酶,。