CL7 / Im7標簽系統(tǒng)

CL7 / Im7蛋白純化系統(tǒng)基于兩個小蛋白（CL7和Im7）之間形成的超高親和力復合物。CL7（16kDa）是與靶蛋白融合的標簽,，Im7（10 kDa）是與瓊脂糖樹脂偶聯(lián)的配體,。

CL7的野生型是CE7 DNase，一種有毒的細菌蛋白。突變被設計成消除其DNA結(jié)合和DNAse活性,，同時保留了對Im7的超高親和力,。

系統(tǒng)組成 

CL7標簽

CL7標簽可以在靶蛋白的N或C末端表達,。我們的質(zhì)粒提供了溶解度標簽，親和標簽和切割位點以及多種克隆選項的組合,。

在對照實驗中,，CL7對溶解度或表達無負面影響。實際上,，CL7改善了在無標簽的大腸桿菌中表達時原本不溶的蛋白質(zhì)的表達水平和溶解度,。當用CL7標簽表達時，幾種臨床和治療上相關(guān)的蛋白質(zhì)從不溶部分轉(zhuǎn)移到可溶部分,。純化變性表達的蛋白質(zhì)不需要變性劑或從包涵體重新折疊,。

Im7樹脂

Im7樹脂由CL7的結(jié)合伴侶Im7固定在瓊脂糖樹脂上組成。由于Im7和CL7之間具有高度特異性的親和力,，脫靶樹脂的結(jié)合極少,。具有35-40 mg / mL的高樹脂結(jié)合能力，可以捕獲大量CL7標記的蛋白,。Im7結(jié)構(gòu)域具有很高的彈性,，使用Gdn-HCl可使樹脂再生并重復使用多達100次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對于從Im7樹脂柱上洗脫目標蛋白至關(guān)重要,。

TriAltus純化我們自己的SUMO和PSC蛋白酶,，由于它們的超高純度，它們具有很高的活性,。TriAltus提供的兩種蛋白酶裂解速度都更快,，并且比競爭對手的產(chǎn)品便宜。 

例如,，如果將60-80 mg的蛋白質(zhì)與5 mL色譜柱結(jié)合,，則流速為0.2 mL / min的20 mL洗脫緩沖液中的1 mg蛋白酶將僅在1.5-2小時內(nèi)洗脫蛋白質(zhì)。少量的蛋白酶是如此稀薄,，以至于可能不需要將其去除,。但是，如果需要，可以使用用于SUMO的His柱和用于PSC的GST進行拋光步驟,。

相撲 

SUMO蛋白酶用于洗脫N末端標記的蛋白,。它是一種高度特異性的酶，可識別SUMO切割位點的三級結(jié)構(gòu),，并且在切割后不留下氨基酸殘基,。它的特異性也使其裂解速度比PSC快。1 ug SUMO可以在30分鐘內(nèi)裂解2 mg底物96％,，在40分鐘內(nèi)裂解99％,。

PSC 

PSC蛋白酶用于切割N或C末端標記的蛋白。它也是高效的：20 ug PSC將在40分鐘內(nèi)以91％的比例裂解2 mg底物,，在60分鐘內(nèi)以99％的比例裂解,。

1個色譜步驟的簡單純化方案

CL7和Im7的鹽獨立性和高度特異性的結(jié)合親和力使其可以實現(xiàn)簡單明了的方案。CL7不是在一步中使用His-trap,，而是在隨后使用特殊標簽精制蛋白質(zhì),，而是在一個色譜步驟中實現(xiàn)了超高純度。

CL7 / Im7的優(yōu)勢 

市場上的每種蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)都可以通過其在兩個參數(shù)下的性能來表征：產(chǎn)量和純度,。CL7 / Im7系統(tǒng)在兩個方面都優(yōu)于His-tag和special標簽,。

屈服

TriAltus開發(fā)了一種用于高粘合力樹脂的高效偶聯(lián)方法。Im7樹脂的結(jié)合能力在35-40 mg / mL范圍內(nèi),。這遠遠優(yōu)于特殊標簽的樹脂,，以及在用于His-trap的Ni柱的頂端。

純度

純度取決于蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對未標記的細胞成分的敏感性,。雜質(zhì)分為兩類：基于標記的靶蛋白/細胞組分相互作用的雜質(zhì),，以及由于細胞組分與色譜柱結(jié)合的配體的非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的雜質(zhì)。

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩沖液的存在下,，CL7與Im7的結(jié)合不會受到干擾。較高的鹽緩沖液可有??效地在純化過程中盡早去除雜質(zhì),，從而獲得干凈的最終產(chǎn)品,。標簽對約0.2-0.3 M的鹽濃度敏感，導致一步層析后純度低,。

非特異性結(jié)合

CL7和Im7彼此高度特定,。這樣可以防止標簽或配體與細胞成分（例如DNA和其他蛋白質(zhì)）之間發(fā)生非特異性相互作用。IMAC系統(tǒng)易與樹脂中的金屬離子發(fā)生非特異性結(jié)合,。

高耐鹽性和高特異性結(jié)合這兩個因素的結(jié)合,，可產(chǎn)生如此高的純度，以至于CL7 / Im7系統(tǒng)僅需一個色譜步驟即可,。

成功純化具有挑戰(zhàn)性的蛋白質(zhì)

多亞基RNA聚合酶

ttRNAP（Thermus嗜熱菌聚合酶）是一個大的?400 kDa的蛋白質(zhì)用5個亞基（α 2 ββ'ω）和4個結(jié)合位點,。傳統(tǒng)上，純化需要5個連續(xù)的色譜步驟才能獲得足夠高的純度以實現(xiàn)高活性。蛋白質(zhì)的純度與其活性直接相關(guān),。將細胞裂解液加載到1.5 M鹽緩沖液中是一步純化的關(guān)鍵,。CL7標簽附著在最大的 β'亞基上， 不會干擾亞基組裝,。 

DNA / RNA結(jié)合蛋白-Cas9

Cas9是CRISPR技術(shù)的關(guān)鍵組成部分,。Cas9活性與其純度直接相關(guān)，但通常需要4-5個色譜步驟才能達到所需的純度,。當Cas9被CL7標記并裝載在1.5 M鹽緩沖液中時,，在一個純化步驟中可以實現(xiàn)99％的純度。該酶在體內(nèi)和體外試驗中均顯示高活性,。

膜蛋白-YidC

YidC是約32 kDa的細菌膜整合酶,。*，膜蛋白難以純化,，因為與細胞成分發(fā)生疏水性接觸會造成污染,。由于His-tag非特異性結(jié)合至其色譜柱，因此在純化的一個步驟后會存在大量雜質(zhì),。CL7對Im7的特異性將這些影響降至低值,，使純度高達99％。

治療蛋白折疊不良-GCSF,，hGH和IFN- α

GCSF,，hGH和IFN-α是FDA批準的三種生物制劑。每個都有兩個內(nèi)部半胱氨酸橋,，當在沒有標簽的大腸桿菌中表達時通常不溶,。純化不溶蛋白通常涉及棘手的重折疊步驟，然后是多個色譜步驟,。CL7增強了蛋白質(zhì)的表達,，穩(wěn)定性和折疊性，因此它們不再表達為包涵體,。